基于活性成分和α-葡萄糖苷酶抑制作用的組織培養(yǎng)牡荊遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)*

周 梅，孟 雪，薛建平，段永波，趙豐蘭△

（1.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230001； 2.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院·安徽省特色資源植物利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000）

糖尿病為全球三大慢性病之一，近年來(lái)發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)［1］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及健康。糖尿病分為1型和2型，其中2型糖尿病患者占比超過(guò)95%［2］，患者需長(zhǎng)期依賴降糖藥。α-葡萄糖苷酶是糖尿病藥物篩選時(shí)的重要靶標(biāo)［3］，是水解葡萄糖苷鍵釋放的葡萄糖關(guān)鍵酶。阿卡波糖作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的常用藥物，作用溫和而持久，但存在不良反應(yīng)［4］，故從植物源中挖掘新型糖尿病治療藥物成為研究熱點(diǎn)［5］。牡荊Vitex negundovar.cannabifolia為馬鞭草科牡荊屬藥用植物，以葉入藥，具有抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化等活性［6］。牡荊葉中典型的活性成分為牡荊素，具有較強(qiáng)的抗糖尿病活性［7］。牡荊主要為野生資源，未開(kāi)展廣泛的人工標(biāo)準(zhǔn)化種植，牡荊素多從其他來(lái)源植物中提取而得［8］，故開(kāi)展牡荊組織培養(yǎng)并進(jìn)行全面評(píng)價(jià)對(duì)于牡荊的規(guī)模化和標(biāo)準(zhǔn)化種植意義重大。李旭群等［9］對(duì)牡荊組織培養(yǎng)進(jìn)行了相關(guān)研究；本課題組孟雪［10］也以未萌發(fā)腋芽為外植體建立了牡荊高效再生體系，但基于活性成分的遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)尚未開(kāi)展。本研究中比較了不同溶劑對(duì)組織培養(yǎng)牡荊葉活性成分提取的影響，并分析了提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以評(píng)價(jià)組織培養(yǎng)牡荊的遺傳穩(wěn)定性，為開(kāi)發(fā)抗糖尿病藥物提供參考，同時(shí)為組織培養(yǎng)牡荊的規(guī)模化種植提供科學(xué)支撐。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex U3000 型液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；JA2003型電子天平（上海菁海儀器有限公司，精度為0.1 mg）；紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海聯(lián)通儀器有限公司）；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀（上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司，功率為900 W，頻率為50 kHz）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

對(duì)硝基苯基-α - D- 吡喃葡萄糖苷（pNPG，梯希愛(ài)< 上海> 化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)為wkq20071504，純度為98%）；α -葡萄糖苷酶（批號(hào)為G5003，純度為98%），蘆丁（批號(hào)為100080-201811，純度為92.6%），均購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；牡荊素對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為111687-201704，純度為98%）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、無(wú)水乙醇、丙酮、乙酸乙酯為分析純或色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮提取與含量測(cè)定

以野生牡荊和本課題組前期獲得的組織培養(yǎng)苗移栽5 個(gè)月的牡荊植株葉片為試驗(yàn)樣品（批號(hào)為2021011）。取野生和組織培養(yǎng)牡荊葉適量研磨成粉，取1 g，分別用乙酸乙酯、酸性乙醇（pH 1.33）、70%乙醇溶液、丙酮于超聲微波萃取儀萃取，真空干燥離心機(jī)抽濾，即得牡荊葉提取物。以蘆丁為對(duì)照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定總黃酮含量［11］。取蘆丁制成質(zhì)量濃度分別為200，400，600，800，1 000 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A510）。以A510（X）為橫坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=164.21X- 12.82（R2= 0.991 6，n= 5）。取牡荊葉提取物，用甲醇溶解，測(cè)定A510，按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成黃酮含量［mg/g（以鮮重計(jì)）］。結(jié)果見(jiàn)圖1 A。

2.2 高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定牡荊素含量

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：518905-902 Agilent HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（B）- 0.1%甲酸水溶液（A），梯 度 洗 脫（0～30 min 時(shí)60%B，30～35 min 時(shí)60%B →100%B，35～37 min 時(shí)100%B →10%B，37～42 min時(shí)10%B）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。每次進(jìn)樣前用初始流動(dòng)相平衡10 min。在此色譜條件下，牡荊素色譜峰與樣品中其他成分的色譜峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)按牡荊素峰計(jì)不低于5 000。色譜圖見(jiàn)圖2。

1.牡荊素A.對(duì)照品溶液 B.供試品溶液圖2 高效液相色譜圖1.VitexinA.Reference solution B.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms

2.2.2 溶液制備

取牡荊素對(duì)照品2.50 mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的牡荊素貯備液，用甲醇梯度稀釋得質(zhì)量濃度分別為20，40，60，80，100 μg/ mL 的系列對(duì)照品溶液。取牡荊葉提取物，用甲醇溶解，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取2.2.2項(xiàng)下系列對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以牡荊素質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.215 3X+0.024 18（R2= 0.998 4，n= 5）。結(jié)果表明，牡荊素質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2 項(xiàng)下質(zhì)量濃度為20，60，100 μg/mL 的對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD分別為0.97%，1.14%，1.05%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為2021011）樣品6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算牡荊素含量。結(jié)果牡荊素含量的RSD為0.45%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為2021001）樣品適量，依法制備供試品溶液，分別于室溫放置0，2，4，6，12，24 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.17%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為2021011）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別加入相當(dāng)于供試品溶液中牡荊素含量50%，100%，150%的牡荊素對(duì)照品，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.72%，RSD為1.21%（n=9），表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.2.4 組織培養(yǎng)和野生牡荊葉的牡荊素含量測(cè)定

取2.1 項(xiàng)下不同溶劑牡荊葉提取物適量，用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/ mL 的供試品溶液，經(jīng)13 000g離心10 min后取上清液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算牡荊素含量。結(jié)果不同溶劑對(duì)牡荊活性成分提取效果的影響依次為酸性乙醇（pH 1.33）>70%乙醇溶液>丙酮>乙酸乙酯。詳見(jiàn)圖1 B。

2.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)

參照林海生等［12］的試驗(yàn)方法，在450 μL 0.1 mol/L PBS（pH=6.8）中加50 μLα-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL）和各溶劑牡荊葉提取物（1.82 mg/mL），37 ℃保溫10 min，加入50 μL 質(zhì)量濃度為3 mg/ mL 的pNPG 溶液，混勻，37 ℃反應(yīng)20 min，加入800 μL（0.1 mol/L）Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測(cè)定405 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A405）。按公式抑制率（%）=1-（A樣品-A樣品空白）/（A對(duì)照-A空白）計(jì)算抑制率。式中，A樣品為樣品組吸光度值（樣品+ 酶+pNPG）；A樣品空白為樣品空白組吸光度值（樣品+ PBS +pNPG）；A對(duì)照為對(duì)照組吸光度值（PBS + 酶+ pNPG）；A空白為空白組吸光度值（PBS+PBS+pNPG）。

當(dāng)野生和組織培養(yǎng)牡荊葉提取物質(zhì)量濃度為1.82 mg/mL 時(shí)，酸性乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率顯著高于其他3種溶劑提取物，且抑制率與各溶劑所提取總黃酮含量變化趨勢(shì)一致，表明黃酮是牡荊抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性物質(zhì)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.3 Effect of extracts extracted with different solvents on inhibitory rate against α - glucosidase

將抑制效果最好的組織培養(yǎng)和野生牡荊葉酸性乙醇（pH 1.33）提取物稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.32，1.36，1.40，1.44 mg/ mL，按上述方法反應(yīng)，并測(cè)定A450，繪制抑制率曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。根據(jù)測(cè)試提取物濃度，反應(yīng)后測(cè)定吸光度，計(jì)算抑制率。得抑制率對(duì)野生牡荊葉總黃酮質(zhì)量濃度的擬合曲線為Y野=0.073 0X野+0.399 5（R2=0.982 4），以抑制率為50%計(jì)算得IC50為1.37 mg/mL；組織培養(yǎng)牡荊葉擬合曲線為Y組=0.099 1X組+0.361 1（R2=0.984 7），以抑制率為50%計(jì)算得IC50為1.41 mg/mL。結(jié)果表明，組織培養(yǎng)與野生牡荊葉對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用相當(dāng)。

2.4 牡荊葉提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)研究

制備質(zhì)量濃度為1.44 mg/mL的酸性乙醇（pH 1.33）提取物，與20，40，60，80，100 mg/Lα -葡萄糖苷酶反應(yīng)，按2.3 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，以不添加（0 mg/mL）提取物為對(duì)照組，計(jì)算反應(yīng)速率。以α-葡萄糖苷酶質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，mg/ mL）、抑制速率［Y，以每分鐘405 nm 波長(zhǎng)處的光密度變化值（ΔOD405）］為縱坐標(biāo)，確定牡荊葉提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線和抑制類型。結(jié)果見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，野生和組織培養(yǎng)牡荊葉提取物抑制速率均通過(guò)原點(diǎn)，表明其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型均為可逆性抑制。

A.野生 B.組織培養(yǎng)圖4 牡荊葉提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)曲線A.Wild Viticis Negundo Folium B.Tissue-cultured Viticis Negundo FoliumFig.4 Kinetic curves of extracts from Viticis Negundo Folium inhibiting α - glucosidase

3 討論

組織培養(yǎng)是植物脫毒復(fù)壯的重要途徑，也是實(shí)現(xiàn)藥用植物標(biāo)準(zhǔn)化種植的必要技術(shù)［13］。不同組織培養(yǎng)條件下再生苗可能出現(xiàn)一定變異，故組織培養(yǎng)苗需進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。關(guān)于組織培養(yǎng)苗的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)多集中在DNA 水平［14-15］，從代謝水平深入評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性對(duì)于組織培養(yǎng)苗的大規(guī)模種植十分重要［16-17］。本研究在前期建立的牡荊組織培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上，基于活性成分和對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用對(duì)組織培養(yǎng)牡荊進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。

溶劑是決定不同植物活性成分的提取率的重要因素之一。本研究中比較了4種溶劑對(duì)牡荊葉總黃酮成分的提取效果，結(jié)果顯示，酸性乙醇（pH 1.33）為牡荊葉總黃酮提取的最佳試劑，所提取的野生和組織培養(yǎng)牡荊中，總黃酮和牡荊素含量均遠(yuǎn)超其他3種溶劑，與文獻(xiàn)［18］的研究結(jié)果一致。表明酸性乙醇（pH 1.33）作為溶劑能實(shí)現(xiàn)牡荊活性成分的高效提取與分離，可為后期研究牡荊活性成分的規(guī)模化提取方法提供參考。

作為牡荊主要的黃酮成分之一，牡荊素在預(yù)防和治療多種疾病方面都有重要作用［19-20］，其可作為α -葡萄糖苷酶抑制劑用于糖尿病治療［21］。體外酶活抑制試驗(yàn)不涉及大鼠等模型動(dòng)物的使用，僅在合適溫度條件下即可完成活性測(cè)定，為酶活力分析提供了一種簡(jiǎn)易方法。因此，本研究中采用體外酶活抑制試驗(yàn)考察提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率，比較組織培養(yǎng)與野生牡荊的差異，評(píng)價(jià)組織培養(yǎng)牡荊的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，以酸性乙醇（pH 1.33）為溶劑的牡荊葉提取物對(duì)α -葡萄糖苷酶表現(xiàn)出良好的抑制效果，組織培養(yǎng)與野生牡荊葉的IC50分別為1.41 mg/ mL 和1.37 mg/ mL，表明組織培養(yǎng)與野生牡荊葉對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用相當(dāng)。牡荊葉提取物對(duì)體外α -葡萄糖苷酶抑制作用的IC50低于藥用植物紅景天［21］，故進(jìn)一步分析了牡荊葉提取物對(duì)α -葡萄糖苷酶的抑制特征。結(jié)果顯示，其抑制類型為可逆性抑制，表明牡荊葉提取物是通過(guò)非共價(jià)鍵與α-葡萄糖苷酶分子結(jié)合而抑制其活性的，臨床治療中可用簡(jiǎn)單方法去除抑制劑而恢復(fù)α-葡萄糖苷酶活性［22］。可見(jiàn)，牡荊具有深入開(kāi)發(fā)為α-葡萄糖苷酶抑制劑的潛力，為糖尿病的治療提供新方法。

綜上所述，組織培養(yǎng)牡荊遺傳穩(wěn)定性較高，在組織培養(yǎng)過(guò)程中未發(fā)生實(shí)質(zhì)性的遺傳變異；體外α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)可作為牡荊遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)的簡(jiǎn)易方法，為牡荊組織培養(yǎng)苗的標(biāo)準(zhǔn)化種植提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。