新型冠狀病毒疫苗受體結(jié)合域抗原含量檢測方法建立*

何 歡，李文東，李玉立，邵天舒，梅 婕，李 瀟

（北京市藥品檢驗研究院·北京市疫苗檢驗中心·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室·中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

高致病性人類冠狀病毒嚴重急性呼吸綜合征（SARS）-CoV、中東呼吸綜合征（MERS）-CoV、新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）嚴重威脅人類健康，分別引起SARS、MERS 和新型冠狀病毒肺炎（COVID - 19）［1-2］。SARS-CoV 于2003 年全球大流行，病死率約為9.56%（774/ 8 098）［3］。MERS - CoV 于2012 年在沙特阿拉伯首次報道，而后在27 個國家/ 地區(qū)流行，病死率約為34.40%（858/ 2 494）［4］。SARS - CoV - 2 于2019 年暴發(fā)，并在全球迅速傳播［1］。與SARS-CoV和MERS-CoV相比，SARS-CoV - 2 造成的感染、死亡和經(jīng)濟破壞更大［2］。新型冠狀病毒疫苗（簡稱新冠疫苗）已上市及后續(xù)研發(fā)涉及品種多、用量大，給藥品監(jiān)管部門帶來了挑戰(zhàn)。因此，建立通用性更強的方法、提高新冠疫苗的檢驗效率迫在眉睫。新型冠狀病毒（簡稱新冠病毒）和其他新出現(xiàn)的致病性人類冠狀病毒的基因組編碼4 個主要的結(jié)構(gòu)蛋白［棘突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣殼（N）］、16 種非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp 1 - 16）和5～8 種輔助蛋白。其中，S 蛋白可進一步分為N- 末端結(jié)構(gòu)域（NTD）和受體結(jié)合域（RBD），在病毒附著中起融合、進入和傳播作用［5］。冠狀病毒S蛋白的RBD必須先與宿主細胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）結(jié)合［6-7］。國內(nèi)的新冠疫苗主要為新冠滅活疫苗和新冠重組亞單位疫苗，其中國內(nèi)上市的新冠重組亞單位疫苗基于RBD 蛋白為免疫靶點［8］，新冠滅活疫苗攜帶整個新冠病毒蛋白，故RBD 蛋白是目前新冠疫苗體外檢測的理想通用靶點。目前，各個新冠疫苗生產(chǎn)企業(yè)均用不同來源的抗體進行體外效力檢測，對目的抗原也無統(tǒng)一的檢測方法。本研究中擬通過建立通用的新冠疫苗RBD 抗原的體外檢測方法，檢測不同技術(shù)路線新冠疫苗的目的抗原含量，為后續(xù)其他技術(shù)路線的新冠疫苗提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Multiskan Sky型酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 試藥

新冠滅活疫苗（Vero細胞，X公司和Y公司各10批）；新冠重組亞單位疫苗（CHO 細胞，Z 公司5 批）；SARSCoV - 2（2019 - nCoV）Spike RBD 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）Kit試劑盒（Sino Biological，Cat號為KIT40592，批號分別為CW15OC2701，CW16MA1401，CW16JU1402），配有包被上嵌合抗SARS - CoV - 2（2019 - nCoV）Spike RBD 的酶標(biāo)板，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的SARS -CoV - 2（2019 - nCoV）Spike RBD 探測抗體（質(zhì)量濃度為0.2 mg/ mL），SARS - CoV - 2（2019 - nCoV）Spike RBD 重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度為30 ng/mL），20 倍洗滌液（每瓶25 mL），20 倍稀釋液（每瓶8 mL），標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（2 mL）；顯色液A（Cat號為5120-0048），顯色液B（Cat號為5120-0037），均購自美國Sera Care公司。

2 方法

2.1 溶液制備

洗滌液：用純化水將20倍洗滌液稀釋20倍。

終止液：向適量純化水中加入硫酸55 mL，用純化水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得。

稀釋液：用純化水將20倍稀釋液稀釋20倍。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1 mL，置標(biāo)準(zhǔn)品安瓿瓶中，溶解，即得質(zhì)量濃度為30 000 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液；用稀釋液將其定量稀釋至質(zhì)量濃度分別為250，125，62.5，31.25，15.62，7.81 pg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

供試品溶液：取X 公司樣品，將樣品和X 解吸附劑按1∶1 混勻，室溫反應(yīng)1 h，每20 min 振蕩混勻，用稀釋液稀釋1 倍，即得供試品溶液X。取Y 公司樣品，將樣品和Y解吸附劑按1∶1混勻，室溫解離（轉(zhuǎn)速為180 r/min）1 h，用稀釋液稀釋1 倍，即得供試品溶液Y。取Z 公司樣品，將樣品和Z 解吸附劑按1∶1 混勻，37 ℃水浴30 min，取10 μL，置990 μL稀釋液中，混勻；取10 μL，置990 μL稀釋液中，混勻；取100 μL，置1.9 mL 稀釋液中，混勻，即得供試品溶液Z。

2.2 方法

檢測方法：實驗前，將試劑盒內(nèi)所有組分和待測樣本溫度恢復(fù)至室溫，將標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品和空白對照（稀釋液）按每孔100 μL 分別加入酶標(biāo)板，3 個復(fù)孔，室溫孵育2 h，洗滌液洗滌3 次，拍干；按每孔100 μL 加入工作濃度檢測抗體，室溫孵育1 h，洗滌液洗滌3 次，拍干；按每孔50 μL分別加入顯色液A和B，室溫避光孵育20 min，每孔加入50 μL 終止液。5 min 內(nèi)讀取450 nm 波長處的吸光度值。

計算方法：將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值減去空白對照吸光度值，得到吸光度校正值。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品吸光度校正值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=a X+b，決定系數(shù)（R2）≥0.99。根據(jù)曲線計算樣品質(zhì)量濃度，再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得樣品RBD抗原含量。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察和定量下限：取2.1項下系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2 項下方法測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算R2，并測定校正標(biāo)樣后回算得出的質(zhì)量濃度，重復(fù)3次。結(jié)果3次試驗中標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2分別為0.996 6，0.995 8，0.997 5（表1）；以6 個質(zhì)量濃度測定校正標(biāo)樣后回算得出的質(zhì)量濃度均在± 15%內(nèi)，符合2020 年版《中國藥典（四部）》通則9012 相關(guān)要求［9］。該方法的定量下限為7.81 pg/mL。

精密度試驗：取2.1 項下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，用稀釋液定量稀釋至質(zhì)量濃度分別為200，150，60，7.81 pg/mL，按2.2項下方法測定校正濃度，每個質(zhì)量濃度在同一酶標(biāo)板上重復(fù)測定6次；或取3批（批號分別為CW150C2701，CW16MA1401，CW16JU1402）標(biāo)準(zhǔn)品，按2.1 項下方法制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2項下方法于3 d內(nèi)測定，每天每個質(zhì)量濃度重復(fù)測定6 次。用校正濃度除以標(biāo)示濃度，計算批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度，準(zhǔn)確度（%）=測得值/真實值×100%，并計算測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)差（變異系數(shù)）。結(jié)果顯示，該方法的批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度均值均在質(zhì)控標(biāo)示值的±15%內(nèi)，變異系數(shù)均在±10%內(nèi)，均符合2020年版《中國藥典（四部）》通則9012 相關(guān)要求［9］，表明儀器精密度良好。詳見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the precision test（n = 6）

稀釋可靠性試驗：取2.1 項下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，用稀釋液定量稀釋至質(zhì)量濃度分別為150，75，37.5 pg/mL，按2.2 項下方法測定，各濃度于同1 d 內(nèi)重復(fù)測定6 次或3 d內(nèi)重復(fù)測定6次。結(jié)果顯示，該方法的批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度均值均在質(zhì)控標(biāo)示值的± 15%內(nèi)，變異系數(shù)均在±10%內(nèi)，均符合2020 年版《中國藥典（四部）》通則9012相關(guān)要求［9］，表明稀釋可靠性良好。詳見表3。

表3 稀釋可靠性試驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the diluted stability test（n = 6）

加樣回收試驗：取X，Y，Z 公司樣品，按2.1 項下方法處理，將X 公司樣品批次2 處理后的樣品X 和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為100 pg/ mL）等體積混勻，將Y 公司樣品批次1 處理后的樣品Y 和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為200 pg/ mL）等體積混勻，將Z 公司樣品批次3 處理后的樣品Z 和標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為125 pg/mL）等體積混勻，按2.2 項下方法測定，重復(fù)3 次。結(jié)果見表4。

表4 不同企業(yè)新冠疫苗加樣回收試驗結(jié)果（%）Tab.4 Results of the recovery test for COVID - 19 vaccines developed by different companies（%）

2.4 樣品含量測定

取X，Y，Z公司的10批、10批、5批樣品，分別按2.1項下方法處理，按2.2 項下方法測定，結(jié)果平均含量分別為302.96 pg/ mL、1 010.80 pg/ mL、42.92 μg/ mL。詳見圖1。

A.X公司 B.Y公司 C.Z公司圖1 新冠重組疫苗RBD蛋白含量測定結(jié)果A.Company X B.Company Y C.Company ZFig.1 Determination results of RBD protein content of COVID - 19 recombinant vaccine

3 討論

在SARS，MERS，COVID-19 中，S 蛋白在受體結(jié)合和膜融合方面起著至關(guān)重要的作用。S 蛋白含有RBD，可特異性識別ACE2 作為其受體［8，10-11］。S 蛋白的RBD是進入病毒宿主細胞受體對接所必需的，也就是“鎖芯”部位［4，6-7］。全長S 蛋白及其抗原片段包括S1亞基、NTD、RBD 和S2亞基，可作為亞單位疫苗研制的重要靶點［10］。目前，基于RBD 的亞單位疫苗已有很多報道［4］。國內(nèi)上市的重組新冠疫苗（5 型腺病毒載體）也是基于新冠病毒S蛋白開發(fā)［8］。

本研究中建立了測定新冠疫苗RBD 抗原含量的方法，所用抗體為重組RBD 單克隆抗體，制備較簡單，且采用的抗體為HRP 標(biāo)記的SARS - CoV - 2（2019 -nCoV）Spike RBD，可直接顯色，無需再加入酶標(biāo)二抗。用HRP 標(biāo)記的一抗可簡化實驗步驟，縮短實驗時間，從而提高檢驗效率。本方法可作為新冠疫苗體外效力評價的手段。

新冠滅活疫苗中有新冠病毒的全蛋白，國內(nèi)上市的新冠重組亞單位疫苗基于RBD 蛋白為免疫靶點。故選擇S 蛋白的RBD 作為新冠滅活疫苗目的抗原的檢測對象。新冠重組亞單位疫苗采用體內(nèi)效力檢測法的體內(nèi)實驗操作周期長，個體差異對結(jié)果影響較大，且需遵循動物實驗倫理準(zhǔn)則。故采用簡便、有效的目的抗原檢驗作為輔助，有助于提高檢驗效率［12-15］，全方位評價疫苗的免疫效果。該方法可用于重組亞單位疫苗目的抗原的檢測。

疫苗目的抗原是效力的決定性指標(biāo)之一，且佐劑與疫苗同等重要，故目的抗原的測定不能作為疫苗效力的唯一決定性因素。如Z 公司目的抗原含量很高，主要是因為Z 公司為重組蛋白疫苗，全病毒蛋白的免疫原性會強于部分蛋白亞基的免疫原性。本研究中建立的方法得到的RBD 抗原含量和Z 公司的藥品說明書基本一致。

該方法可實現(xiàn)用一致的靶點和方法檢測新冠滅活疫苗和重組亞單位疫苗的目的抗原。通過查詢國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站，已上市新冠疫苗主要包括滅活疫苗、亞單位疫苗、腺病毒載體疫苗等。國內(nèi)上市的新冠腺病毒載體疫苗是以新冠病毒S 蛋白為免疫對象，而S 蛋白包括RBD 蛋白。因此，該方法理論上可用于新冠腺病毒載體疫苗目的抗原的體外檢測。后期將采用新建的ELISA 法進行新冠腺病毒載體疫苗目的抗原體外檢測，以實現(xiàn)更多新冠疫苗品種在檢測項目、檢測靶點上的統(tǒng)一，進一步提高檢驗效率。

綜上所述，所建立的新冠病毒疫苗多種技術(shù)路線適用于目的抗原檢測，方法學(xué)驗證結(jié)果符合相關(guān)要求，能顯著提高檢測效率。