高效液相色譜法測定維生素和礦物質(zhì)復(fù)方制劑中維生素K2含量

楊善巖，黃鳳琴，劉麗云，馮鋒將

（杭州民生健康藥業(yè)股份有限公司，浙江 杭州 311100）

天然維生素K 是一類脂溶性維生素，有維生素K1和維生素K2兩類［1］。其中，維生素K2又稱甲萘醌，是唯一具有生物活性的維生素K，維生素K1須在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化為維生素K2才能被人體吸收。維生素K2為系列化合物［1］，其中以七烯甲萘醌（MK-7）的生物活性和生物利用度最優(yōu)［2-4］。維生素K2是人體必需維生素，參與骨骼代謝和骨細(xì)胞生長［5］，日本于1995 年首次將其作為骨質(zhì)疏松藥物應(yīng)用于臨床［6］。近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2具有廣泛的生物活性和藥用價值，如促進(jìn)凝血［7］、防止并逆轉(zhuǎn)心血管鈣化［8］、降低2 型糖尿病風(fēng)險［9］、預(yù)防老年癡呆［2］、預(yù)防肝硬化［10］、抗腫瘤［11-12］等。隨著維生素K2藥用價值的逐漸凸顯，其已成為藥品和保健品添加劑的熱點［13-16］。維生素K2遇光和堿不穩(wěn)定，但耐酸、耐熱，多通過微囊包埋增加穩(wěn)定性。包埋后有效提高了維生素K2的穩(wěn)定性，但也增加了檢測難度。因為囊殼多為高分子材料，檢測前需用溶劑將囊殼溶解，對維生素K2進(jìn)行提取，整個過程要避免光、堿對維生素K2的降解，還要保證提取完全。單一原料中維生素K2的檢測方法相對簡單，采用異丙醇等溶劑直接萃取［17-21］，但不適用于復(fù)方制劑，特別是多種維生素和礦物質(zhì)復(fù)方制劑。因為復(fù)方制劑基質(zhì)復(fù)雜、不溶性成分較多，直接萃取法存在難以定容、提取不完全、雜質(zhì)干擾嚴(yán)重等問題，嚴(yán)重影響定量的準(zhǔn)確性。隨著老齡化的加劇和人們健康意識的提高，維生素K2相關(guān)的藥品和保健品研發(fā)成為熱點。但缺少適用于多種維生素和礦物質(zhì)復(fù)方制劑中維生素K2的國標(biāo)檢測方法。故本研究中建立了適用于測定多種維生素和礦物質(zhì)復(fù)方制劑中維生素K2含量的高效液相色譜法，為此類藥品和保健品的開發(fā)及質(zhì)量控制提供保障。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BT125D 型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器<北京> 有限公司，精度為十萬分之一）；1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；IKA Multi Drive MI 250型粉碎機(jī)（德國IKA公司）；KQ-300DE型超聲波振蕩器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為1 000 W，頻率為45 kHz）；ST16R型離心機(jī)（美國Thermo公司）。

1.2 試藥

21 金維他?多種維生素礦物質(zhì)片（小試樣品，杭州民生健康藥業(yè)股份有限公司，批號為H20H007）；MK-7標(biāo)準(zhǔn)品（美國Usp Reference Standard 公司，批號為R080L0，純度為97.80%）；甲醇、異丙醇（色譜純，德國Merck 公司）；鹽酸（分析純，國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo 30105-154630型ODS柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣量：50 μL。

2.2 溶液制備

精密量取濃鹽酸（36.0%～38.0%）125 mL，置500 mL容量瓶中，用異丙醇定容，即得異丙醇- 3 mol/L 鹽酸溶液。

避光操作，取KM - 7 標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加適量異丙醇-3 mol/L鹽酸溶液，超聲15 min使溶解，定容，即得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的MK-7 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液；精密移取MK-7 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加異丙醇- 3 mol/ L鹽酸溶液稀釋并定容，即得質(zhì)量濃度為10 μg/ mL 的MK-7標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

避光操作，取樣品粉末（過80目篩）2.0 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，精密量取異丙醇-3 mol/L鹽酸溶液50 mL，搖勻，超聲［功率為（1 000 ± 5）W，頻率為45 kHz± 5 kz］振蕩20 min（每10 min 搖勻1 次），超聲結(jié)束后，常溫離心（轉(zhuǎn)速為8 000 r/min）10 min，取上清液，0.45 μm濾膜濾過，取濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察［22-24］

專屬性試驗：精密量取空白溶液（異丙醇-3 mol/L鹽酸溶液）及2.2 項下MK-7 標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果供試品溶液和MK-7標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜中均在7.5～8.5 min 處有吸收峰，且空白溶液無干擾。詳見圖1。

1.MK - 7A.空白溶液 B.MK - 7標(biāo)準(zhǔn)品溶液 C.供試品溶液圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖1.MK - 7A.Blank solution B.MK - 7 standard solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項下MK-7標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為10 μg/mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，用異丙醇-3 mol/L 鹽酸溶液溶解并定容至10 mL，即得質(zhì)量濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液（臨用現(xiàn)配），按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以MK-7 標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=65.47X+0.04（R2=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，MK-7標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度在0～1.0 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限確定：取MK - 7 標(biāo)準(zhǔn)品適量，按2.2項下方法制備質(zhì)量濃度為0.001～0.020 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定。以信噪比（S/N）為3 時的標(biāo)準(zhǔn)品濃度確定檢測限，以S/N為10時的標(biāo)準(zhǔn)品濃度確定定量限。結(jié)果檢測限為0.12 μg/g，定量限為0.36 μg/g。

精密度試驗：取樣品6 份，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，按公式C=C0V/m計算含量（式中，C為樣品中MK-7 的含量，C0為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的樣品中MK - 7 的含量，V為樣品定容體積，m為樣品質(zhì)量）。結(jié)果含量的RSD為2.85%（n=6），均值與理論值的偏差為1.67%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下MK-7 標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，分別于室溫放置0，1，2，4，8，12 h 時按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算MK-7標(biāo)準(zhǔn)品的含量。結(jié)果的RSD為0.99%（n=6），表明MK-7標(biāo)準(zhǔn)品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取樣品1.0 g，精密稱定，共9 份，分別置100 mL 棕色容量瓶中，分別按低（80.00%）、中（100.00%）、高（120.00%）濃度加入質(zhì)量濃度為10 μg/mL的MK - 7 標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0，1.2，1.5 mL，各3 份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Result of the recovery test（n = 9）

3 討論

3.1 前處理條件優(yōu)化

維生素K2人體需要量微小，在產(chǎn)品中的含量多以微克（μg）計，產(chǎn)品中往往含有一些不溶或難溶的原輔料，特別是一些復(fù)雜的維生素和礦物質(zhì)復(fù)方制劑（如21金維他?）往往含有十幾種甚至二十幾種原輔料，樣品前處理困難。因此，根據(jù)產(chǎn)品特點，通過提取液定量的形式，結(jié)合超聲提取、離心分離法最大限度地提高維生素K2的提取率。同時，為避免維生素K2見光分解而影響檢測的準(zhǔn)確度，試驗過程應(yīng)全程避光。

3.2 色譜條件選擇

影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確定量的最主要因素為前處理過程中維生素K2的提取率，但文獻(xiàn)［16］中記載的方法主要適用于維生素K2含量較高的原料級別的測定，而維生素和礦物質(zhì)復(fù)方制劑中維生素K2含量較微量，故本研究中以50 μL為進(jìn)樣量。

3.3 檢測波長選擇

取MK - 7 標(biāo)準(zhǔn)品適量，采用紫外- 可見分光光度計于200～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果MK - 7 標(biāo)準(zhǔn)品溶液于254 nm波長處有較大紫外吸收，故選擇254 nm為檢測波長。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，符合相關(guān)指南［22-24］要求，可滿足藥品、保健品領(lǐng)域研發(fā)或生產(chǎn)過程中多種維生素和礦物質(zhì)復(fù)方制劑中維生素K2的定量檢測。