不同產地林下藥材三葉青品質差異比較

陳黎明，徐帆，柳新紅，夏鵬國，梁宗鎖

(1. 漢中市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000；2. 浙江理工大學 生命科學與醫藥學院，浙江 杭州 310018；3. 浙江省林業技術推廣總站，浙江 杭州 310020）

三葉青Tetrastigmahemsleyanum為葡萄科Vitaceae崖爬藤屬Tetrastigma植物，是我國民間一種珍稀中草藥，主要分布于浙江、福建、廣西、貴州等產地。現代研究表明三葉青無毒無害，能夠調節機體免疫，且對肺癌、肝癌、消化系統腫瘤、流感病毒等多種疾病具有強效藥理作用，在《浙江省中藥飲片炮制規范》（2015 年版）已收載三葉青[1]。

三葉青一般以扦插繁殖為主，也有以塊根繁殖，種植3 年后，每年的冬至—驚蟄期間（休眠期）采摘的塊根，質量最好[2]。不同產地三葉青中的有效成分含量會因產地環境、生態因子、氮素水平等不同而具有較大的差異。當前，三葉青未在《中國藥典》的名錄內，并無統一的質量評價標準，藥材質量良莠不齊。因此，本文對不同產地三葉青依據《中國藥典》的規定進行水分、醇溶性浸出物含量等的測定，按照《浙江省中藥飲片炮制規范》（2015 年版）的要求評價質量高低，并且利用HPLC 技術檢測三葉青中有效成分的含量，以期找出質量上乘的三葉青種質資源，為三葉青產業的發展提供參考。

2 材料與方法

2.1 試驗儀器與試劑

研究所用主要儀器有高速中藥粉碎機、冷凍離心機和遠紅外快速干燥箱等，具體信息見表1。

表1 主要儀器Tab. 1 Main instruments

主要試劑：色譜級甲酸（上海麥克林生化科技有限公司）；色譜級乙腈和甲醇（德國默克公司）。虎杖苷對照品、紫云英苷對照品、白藜蘆醇對照品、槲皮素對照品和山柰酚對照品（均購于上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）。乙醇（無水）、甲醇等試劑均為分析純（杭州高晶精細化工有限公司）。其余生理試劑購于杭州科德諾生物技術有限公司。

2.2 試驗材料

2019 年7 月，分別在浙江省溫嶺市、福建省沙縣和寧化縣、貴州省天柱縣、廣西壯族自治區南丹縣采集三葉青塊根樣本。共采集了5 批，每批隨機采集20 株。樣本信息與種植來源見表2。

表2 三葉青樣品信息Tab. 2 Sample information of T. hemsleyanum

2.3 三葉青藥材處理

取5 個不同產地三葉青的新鮮塊根樣本，舍棄須根后用去離子水洗凈瀝干后，將塊根切片，于55 °C 紅外烘干，用高速中藥粉碎機粉碎，過60 目篩。4 °C 保存備用。

2.4 三葉青中的水分測定和化學成分測定

2.4.1 水分含量測定 采用《中國藥典》（2015 年版）中的水分測定法和烘干法。稱取三葉青粉末2 ～ 5 g，于稱量瓶中平鋪，厚度不超過5 mm，稱定，開啟瓶蓋在100 ～ 105 °C 干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30 min，稱定，再在上述溫度下干燥1 h，放冷，稱量，至連續兩次稱量的差異不超過5.00 mg 為止，根據減失的質量，計算三葉青樣的含水量（%）[3]。

水分含量（%）= [樣本質量－（烘干后總質量－稱量瓶質量）] /樣本質量×100 %

2.4.2 浸出物含量測定 采用《中國藥典》（2015 年版）中的醇溶性浸出物測定法。精密稱取三葉青樣本約2.00 g，稱定質量（準確至0.01 g），置錐形瓶中，溶劑為70%乙醇，以干燥品計算三葉青樣本中醇溶性浸出物的含量（%）[4]。浸出物含量（%）= [ 樣本質量－（烘干后總質量－蒸發皿質量）] / 樣本質量 ×100 %

2.4.3 總黃酮含量測定 總黃酮的測定采用王萍等[5]的方法，使用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法稍加修改。

（1）試劑的配置。①配置5%亞硝酸鈉溶液：準確稱取5.00 g 亞硝酸鈉，加入去離子水溶解并定容至100 mL容量瓶中；②配置10%硝酸鋁溶液：準確稱取20.00 g 硝酸鋁九水合物固體，加入93.6 mL 去離子水溶解；③配置4 %氫氧化鈉溶液：精確稱取10.00 g 氫氧化鈉固體，用去離子水溶解并定容至250 mL；④配置蘆丁標準液0.02 mg·mL-1：準確稱取1.09 mg 蘆丁對照品，加入適量70%乙醇溶解，并用去離子水定容至50 mL 容量瓶，混勻，得標準溶液濃度為0.218 mg·mL-1。保存于4 °C 冰箱中，備用。

（2）標準曲線的繪制。分別精密移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 蘆丁標準液對照品溶液于10 mL容量瓶中，加70%乙醇至4 mL，再精密加入0.40 mL 的5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min；精密加0.40 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min；精密加4.00 mL 的4%氫氧化鈉溶液，最后加乙醇定容，搖勻，靜置15 min，使反應完全后在510 nm 波長處測定吸光度（A）[6]。

求得標準曲線的回歸方程為y= 0.011 10x+ 0.002 267，R2= 0.999 7，如圖1。式中，x為濃度，y為吸光度。

圖1 蘆丁標準曲線Fig. 1 Standard curve of rutin

2.4.4 總酚含量測定 總酚含量測定采用張萍等[7]的方法，即采用福林酚比色法（Folin ciocalteu），并稍加修改。

（1）試劑的配制。配置16%碳酸鈉溶液：精確稱取16.00 g 碳酸鈉固體，用去離子水溶解定容至100 mL 容量瓶中。配置0.10 mg·mL-1沒食子酸標準液：準確稱取10.00 mg 沒食子酸（gallic acid）對照品，加適量無水乙醇溶解，并用去離子水定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，得濃度為0.10 mg·mL-1標準溶液。保存于4 °C 冰箱中，備用。

（2）標準曲線的繪制。分別精密移取0、25、50、75、100、125、150 μL 沒食子酸標準母液于5 mL 容量瓶中，依次加入適量去離子水搖勻，200 μL 福林酚試劑混合，充分振蕩后于室溫下反應10 min 后加入16%碳酸鈉溶液600 μL，得到沒食子酸標準溶液濃度為 0.5 ～ 3 mg·mL-1的系列對照品溶液。搖勻后在室溫下放置，避光反應1.5 h。經福林試劑顯色后于762 nm 波長處測定吸光度（A）。

求得標準曲線的回歸方程為y= 0.104 2x－0.005 600，R2= 0.998 9，如圖2。式中x為濃度，y為吸光度。

圖2 沒食子酸標準曲線Fig. 2 Standard curve of gallic acid

2.5 HPLC 檢測

2.5.1 樣品的制備 標準品溶液的制備：精密稱取虎杖苷、紫云英苷、白藜蘆醇、槲皮素和山柰酚對照品，加入色譜級甲醇配置成1.00 mg·mL-1的混合標準品溶液，備用。每個樣品設置三個重復。

三葉青提取液的制備：稱取5 個產地三葉青塊根粉末各1.00 g，加入80%甲醇10 mL 稱定，超聲30 min（50 °C，功率200 W），冷卻，用80%甲醇補足失重。8 000 r·min-1離心10 min，取上清液，重復提取兩次，合并兩次上清液，定容至10 mL，即得濃度為0.10 g·mL-1的三葉青提取液，待測[8]。每個樣品設置三個重復。

2.5.2 HPLC 測定有效成分含量 HPLC 測定方法參考王靜的測定方法，測定5 個三葉青樣品中的有效成分含量。

色譜條件：采用Sunfire C18 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）－0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0 ～ 20 min，5% ～ 15% A；20 ～ 60 min，15% ～ 30% A；60 ～ 85 min，30% ～ 100% A；90 ～ 100 min，5% A），流速0.8 mL·min-1，柱溫30 °C，進樣量20 μL，檢測波長210 ～ 400 nm[9]。

混合標準品溶液的色譜圖見圖3。1、2、3、4、5 色譜峰分別為虎杖苷、紫云英苷、白藜蘆醇、槲皮素和山柰酚。

圖3 標準品HPLC 指紋圖譜Fig. 3 HPLC fingerprint of standard

標準曲線的繪制：以標準品濃度（μg·mL-1）為橫坐標，對應峰面積（mAU）為縱坐標繪制標準曲線（見圖4），其線性方程如下。

圖4 三葉青中有效成分標準品的標準曲線Fig. 4 Standard curve of the standard substance of active ingredients in T. hemsleyanum

虎杖苷：y= 132 555x－11 329，R2= 0.999 9；

紫云英苷：y= 48 072x－1 116.8，R2= 0.999 9；

白藜蘆醇：y= 242 503x－15 429，R2= 0.999 9；

槲皮素：y= 42 260x+ 15 241，R2= 0.999 1；

山柰酚：y= 69 014x－13 370，R2= 0.999 9。

三葉青塊根中虎杖苷、紫云英苷、白藜蘆醇、槲皮素和山柰酚的含量均在 0.5 ～ 50 μg·mL-1范圍內呈現線性關系。

2.6 數據統計分析

所有數據均采用Excel 軟件進行統計，用SPSS 26.0 軟件進行分析。圖形的繪制使用GraphPad Prism 8 軟件。

3 結果與分析

3.1 不同產地三葉青中的水分和浸出物含量比較

將來自不同產地的5個三葉青樣本按照2.4節方法進行測定及計算，得到5個產地三葉青的水分含量（表3）。5 個不同產地三葉青的水分含量范圍在5.97% ～ 11.01%。其中以GX-ND 的水分含量最高，平均含量為11.01%，水分含量最低的為FJ-SX，平均含量僅為5.97%。

表3 不同產地三葉青水分與浸出物含量比較Tab. 3 Water and extract content of T. hemsleyanum from different producing areas

將來自不同產地的5 個樣本按照2.4 節方法進行測定及計算，得到5 個產地的醇溶性浸出物含量（表3）。5 個不同產地三葉青的浸出物含量范圍在9.24% ～ 18.82%，根據《浙江省中藥飲片炮制規范》（2015 年版）規定[1]，均符合要求（即9%）。但不同產地三葉青的浸出物含量存在較大差異。其中ZJ-WL 的浸出物含量最高，為18.82%，GX-ND 的浸出物平均含量最低，僅為9.24%。

3.2 不同產地三葉青總黃酮和總酚含量比較

由圖5 可知，不同產地三葉青的總黃酮含量在78.94 ～ 123.84 mg·g-1DW，且不同產地的三葉青的總黃酮含量存在顯著差異（P<0.05）。其中，ZJ-WL 的總黃酮含量顯著高于其他4 個產地三葉青的總黃酮含量（P<0.05），ZJ-WL 的總黃酮含量顯著高于FJ-NH、FJ-SX 和GX-ND（P<0.05），FJ-NH、FJ-SX 和GX-ND 的總黃酮含量沒有顯著差異。5 個產地三葉青中，ZJ-WL 的總黃酮含量最高，達到123.84 mg·g-1DW；其次為GZ-TZ，其總黃酮含量為105.40 mg·g-1DW；而FJ-NH 和 FJ-SX 的總黃酮含量分別為81.12 mg·g-1DW 和78.94 mg·g-1DW，與GX-ND 的總黃酮含量 79.21 mg·g-1DW 較為接近。

圖5 不同產地三葉青總黃酮和總酚含量比較Fig. 5 The content of total flavonoids and phenols in T. hemsleyanum from different producing areas

從圖5 還可看出，不同產地三葉青總酚含量在6.89 ～ 51.03 mg·g-1DW，不同產地的三葉青的總酚含量差異顯著（P<0.05）。其中，FJ-SX 和ZJ-WL 的總酚含量無顯著差異，但顯著高于其他3 產地三葉青的總酚含量（P<0.05），GZ-TZ 和FJ-NH 的總酚含量無顯著差異，但與GX-ND 的總酚含量存在顯著差異（P<0.05）。5 個產地三葉青中， FJ-SX 的總酚含量最高，達到51.03 mg·g-1DW；其次為ZJ-WL，其總酚含量為48.53 mg·g-1DW；GZ-TZ 和FJ-NH 的總酚含量分別為40.26 和40.11 mg·g-1DW；GX-ND 的總酚含量最低，僅為34.08 mg·g-1DW。

3.3 不同產地三葉青的有效成分含量比較

將5 個產地的三葉青進行HPLC 檢測，對其中的虎杖苷、紫云英苷、白藜蘆醇、槲皮素和山柰酚5 種有效成分含量進行分析比較，結果如圖6。由圖6 可知，不同產地三葉青的虎杖苷、紫云英苷、白藜蘆醇、槲皮素和山柰酚含量均存在顯著差異（P<0.05）。

圖6 不同產地三葉青有效成分含量比較Fig. 6 The content of effective ingredients in T. hemsleyanum from different producing areas

虎杖苷在FJ-SX 中含量最高，達到32.41 mg·kg-1DW；其次是ZJ-WL，含量為21.57 mg·kg-1DW；再次為GZ-TZ，含量為9.45 mg·kg-1DW；在GX-ND 和FJ-NH 中的含量較低，分別為4.53、3.08 mg·kg-1DW。紫云英苷在GZ-TZ 中含量最高，達55.84 mg·kg-1DW；其次是GX-ND 和ZJ-WL，含量分別為14.43、12.70 mg·kg-1DW；在FJ-SX、FJ-NH 中均未檢測出。白藜蘆醇含量在FJ-SX 中含量最高，達29.58 mg·kg-1DW；其次為GZ-TZ，含量為22.53 mg·kg-1DW；而在FJ-NH、GX-ND 和ZJ-WL 中的含量較低，分別為6.63、4.06 和2.63 mg·kg-1DW，且與前兩者均差異顯著（P<0.05）。槲皮素在ZJ-WL 中的含量最高，為21.35 mg·kg-1DW；其次是FJ-NH，為13.75 mg·kg-1DW；在GX-ND（廣西南丹）中的含量最低，僅為1.47 mg·kg-1DW。山柰酚在 ZJ-WL 中含量最高，達14.14 mg·kg-1DW；其次是FJ-SX，為5.28 mg·kg-1DW；在GZ-TZ 中的含量最低，僅為2.48 mg·kg-1DW。

3.4 三葉青各指標的相關性分析

采用SPSS 26.0 軟件對不同產地三葉青的9 個指標進行相關性分析（Pearson）[10]，并繪制相關系數的矩陣表，結果見表4。

表4 三葉青各指標的相關性分析Tabl. 4 Correlation analysis of indicators of T. hemsleyanum

由表4 可知，三葉青的9 個指標呈現出不同程度的相關性。三葉青的浸出物含量與總酚、虎杖苷、槲皮素含量呈極顯著正相關（P<0.01），與總黃酮、山柰酚含量呈顯著正相關（P<0.05）；總黃酮含量和槲皮素、山柰酚含量呈現極顯著正相關（P<0.01）；總酚含量與虎杖苷含量呈極顯著正相關（P<0.01），與槲皮素、山柰酚含量呈顯著正相關（P<0.05）；虎杖苷含量與白藜蘆醇含量呈顯著正相關（P<0.05）；槲皮素含量與山柰酚含量呈顯著正相關（P<0.05）；而三葉青的水分含量和白藜蘆醇含量呈極顯著負相關（P<0.01）。

4 結論與討論

4.1 討論

按照《中國藥典》（2015 年版）對5 個產地的三葉青進行常規藥材檢測，發現不同產地三葉青的水分含量為5.97% ～ 11.01%，平均含量為7.94%；浸出物含量為9.24% ～ 18.82%，平均含量為15.04%，均＞9%，符合《浙江省中藥飲片炮制規范》（2015 年版）的要求[1]，其中浙江溫嶺產三葉青的浸出物含量最高，為18.82%。

本研究結果表明，5 個產地三葉青的總黃酮含量和總酚含量存在顯著差異（P<0.05）。該結果與鄭軍獻[11]、黎穎菁等[12]的研究結果相一致。總黃酮含量最高的三葉青為ZJ-WL（浙江溫嶺），其總黃酮含量達到123.84 mg·g-1DW。總酚含量最高的三葉青為FJ-SX（福建沙縣），達到51.03 mg·g-1DW，其次為ZJ-WL（浙江溫嶺），其含量為48.53 mg·g-1DW。若僅考慮總黃酮和總酚含量來選擇良種，浙江產三葉青ZJ-WL 較其他省份的三葉青更佳。由三葉青中有效成分含量研究結果顯示：虎杖苷在FJ-SX 中含量最高，為32.41 mg·kg-1DW；紫云英苷在GZ-TZ（貴州天柱）中含量最高，為55.84 mg·kg-1DW，而在FJ-SX 和FJ-NH（福建寧化）2 個樣本中未能檢測出；在FJ-SX 中的白藜蘆醇含量最高，為29.58 mg·kg-1DW；槲皮素在ZJ-WL 中含量最高，為21.35 mg·kg-1DW；在ZJ-WL 中的山柰酚含量最高，為14.14 mg·kg-1DW，約為其他省份三葉青中山柰酚含量的3 倍。基于總黃酮、總酚含量和5 種有效成分含量的研究結果，浙江產的三葉青樣本具有較高的指標，可為今后的選種提供參考。

中藥材的化學成分不同會影響其藥理活性的發揮，且易受地理環境變化的影響，如產地不同其環境因子會發生變化[13]，進而影響中藥材中次生代謝產物的積累。相關研究表明，不同產地三葉青在黃酮類成分[14]和酚類成分[8]的含量上存在較大差異。本文對5 個產地的三葉青的化學成分進行了含量測定和HPLC 指紋圖譜研究，結果顯示，不同產地的三葉青大體上具有相同的化學成分，但是有效成分的含量卻具有明顯差異。不同產地的地理和氣候因子如海拔、降水量、氣溫等生態因子均會影響三葉青塊根中總黃酮等物質的合成和積累[15]，同樣地，不同生長年限也會影響三葉青內含物的積累。總黃酮、總酚等化學物質的含量與其生物合成相關酶的轉錄水平和表達量呈正相關的關系[16]。三葉青塊根中有效成分的積累與相關合成酶基因的表達量密切相關，如PAL、CHS和CHI在黃酮代謝途徑中起著關鍵性的調控作用[17]，產地不同這些關鍵酶活性的差異顯著。

相關性分析能夠發現多項指標間潛在存在的相互制約關系[18]。本研究中相關性分析結果顯示：三葉青的水分、白藜蘆醇含量呈顯著負相關（P<0.05）；浸出物含量與總酚、虎杖苷、槲皮素含量呈極顯著正相關（P<0.01）；總黃酮含量與槲皮素、山柰酚含量呈極顯著正相關（P<0.01）；總酚含量與虎杖苷含量呈極顯著正相關（P<0.01），與槲皮素、山柰酚含量呈顯著正相關（P<0.05）；5 種有效成分之間，虎杖苷含量和白藜蘆醇含量呈顯著正相關（P<0.05），槲皮素與山柰酚含量呈顯著正相關（P<0.05）。對不同產地三葉青不同指標進行含量的測定并分析其差異，可為三葉青的質量評價提供必要的參考依據。

4.2 結論

本文通過對來自5 個不同產地（浙江溫嶺、福建沙縣、福建寧化、貴州天柱、廣西南丹）的三葉青進行常規檢測，并使用高效液相色譜法測定5 種有效成分含量，結果發現不同產地三葉青的各項指標均存在顯著差異，浙江產三葉青的各項指標均位居前列。