雙膦酸鹽類藥物對區(qū)域骨代謝加速過程中巨噬細胞極化狀態(tài)的影響

郭珍珍 程筠 黃文霞

雙膦酸鹽(bisphosphonates, Bps)類藥物是一類化學合成藥物, 主要作用于骨組織并影響骨代謝, 在臨床中主要應(yīng)用于抗代謝骨病, 如骨質(zhì)疏松癥、惡性腫瘤引發(fā)的高鈣血癥和骨痛癥等［1,2］。近年來, 雙膦酸鹽類藥物在癌癥患者中預(yù)防癌癥骨轉(zhuǎn)移的應(yīng)用逐漸增多, 與此同時, 與雙膦酸鹽類藥物相關(guān)的區(qū)域骨代謝加速的報道也逐漸增多。由雙膦酸鹽引起的頜骨壞死(bisphosphonates-related osteonecrosis of jaw, BRONJ) 的機制尚不完全清楚, 對于雙膦酸鹽類藥物相關(guān)性區(qū)域骨代謝加速的治療以及預(yù)防都還需要進一步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇40 只雌性SD 大鼠, 體重(200±20) g, 購自于斯貝(北京)生物技術(shù)有限公司, 獲得實驗動物許可證號。將大鼠隨機分為空白對照組、ZA 組、IL-17 組、laq 組, 每組10 只。

1.2 方法

1.2.1 實驗儀器及試劑 雙膦酸鹽類藥物(唑來膦酸)、Micro CT、X 射線牙機片、3%過氧化氫溶液、4%多聚甲醛、PBS、3% BSA、兔抗大鼠CD68 抗體、兔抗大鼠INOS 抗體、兔抗大鼠CD206、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)、大鼠抗鼠IL-17 單克隆抗體、拉喹莫德。

1.2.2 實驗方法 ZA 組、IL-17 組、laq 組腹腔注射唑來膦酸建立動物模型, 空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。對四組大鼠行頜骨拔牙術(shù), IL-17 組大鼠給予抗大鼠IL-17 中和抗體, laq 組大鼠給予拉喹莫德。拔牙術(shù)后第8 周處死大鼠, 取完整骨固定, 實施X 線檢查與Micro-CT 掃描, 分析其骨代謝情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差( x-±s)表示, 采用t 檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 模型建立

2.1.1 拔牙創(chuàng)愈合情況 空白對照組大鼠拔牙創(chuàng)愈合情況良好, 無死骨形成, 骨代謝尚可。見圖1A。ZA 組、IL-17 組、laq 組大鼠均發(fā)生了不同程度的黏膜愈合不良, 骨面暴露, 拔牙創(chuàng)延遲愈合, 拔牙窩空虛。見圖1B。

2.1.2 骨代謝情況 空白對照組BRONJ 發(fā)病率為0(0/10), ZA 組為80%(8/10), IL-17 組為30%(3/10), laq組為60%(6/10), IL-17 組、laq 組較ZA 組的發(fā)病率呈現(xiàn)了下降的趨勢。見圖2A。ZA 組、IL-17 組和laq 組大鼠拔牙創(chuàng)部位的BV/TV 均明顯低于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明ZA 組、IL-17 組和laq 組大鼠骨代謝較快。見圖2B。

圖2 四組大鼠骨代謝情況

2.2 骨密度情況 X 線片與Micro-CT 檢查顯示BRONJ 大鼠拔牙創(chuàng)出現(xiàn)明顯骨密度降低, 拔牙窩空虛,拔牙創(chuàng)內(nèi)成骨不良并伴有死骨形成；空白對照組中的大鼠頜骨黏膜愈合良好, 骨密度正常, 骨代謝穩(wěn)定。見圖3。

圖3 大鼠頜骨影像學檢查

2.3 唑來膦酸有助于巨噬細胞向M1 型極化, 阻斷或抑制IL-17 活性可抑制巨噬細胞向M1 型細胞極化相比于空白對照組大鼠, BRONJ 大鼠中觀察到大量CD68+巨噬細胞浸潤, 同時, iNOS+巨噬細胞也大量出現(xiàn), 而CD206+巨噬細胞卻呈現(xiàn)了明顯降低的趨勢。ZA組、IL-17 組和laq 組中的CD68+巨噬細胞、iNOS+巨噬細胞、CD206+巨噬細胞的表達量均與空白對照組呈現(xiàn)出明顯差異；ZA 組分別與IL-17 組和laq 組相比較,3 種細胞的數(shù)量也呈現(xiàn)差異, 說明唑來膦酸不僅引起大量巨噬細胞的浸潤, 還可促進巨噬細胞向M1 型細胞極化；阻斷或抑制IL-17 活性能夠減少巨噬細胞浸潤,并抑制巨噬細胞向M1 型細胞極化；相比較空白對照組大鼠, 在BRONJ 大鼠中iNOS 陽性巨噬細胞明顯占優(yōu)勢, M1 型細胞與 M2 型細胞的比例更為凸顯, 說明M1 型巨噬細胞在大鼠形成BRONJ 的過程中具有促進作用, 是大鼠發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。

3 討論

雙膦酸鹽類藥物被認為是治療骨科相關(guān)疾病的一線藥物。雙膦酸鹽最早用于紡織業(yè)和石油工業(yè), 在20 世紀60 年代, 國外學者發(fā)現(xiàn)了其藥理活性。骨的主要礦物組分為羥基磷灰石［Ca10(PO4)6(OH)2, HA］, 雙膦酸鹽能夠通過與羥基磷灰石結(jié)合抑制其溶解來防止鈣化, 因此認為該類藥物能夠?qū)趋兰膊“l(fā)揮潛力作用［3-5］。同時, 在醫(yī)療技術(shù)的不斷深入研究下, 相關(guān)治療藥物得到研發(fā)與應(yīng)用, 且親和力高, 毒副作用小, 能夠針對Paget 病、骨質(zhì)疏松癥、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的高鈣血癥進行有效治療, 取得了不錯效果, 其中一類患者則為骨質(zhì)疏松癥婦女。

與常規(guī)治療比較, 雙膦酸鹽治療可更大程度降低骨特異性堿性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)水平, 有利于骨代謝功能改善。唑來膦酸是一種雙膦酸鹽, 具有非常高的藥理活性。對于破骨細胞而言, 能夠選擇性地對唑來膦酸加以吸收, 并且能夠抑制其的活性, 這使得細胞凋亡作用變得更明顯, 而破骨細胞也會變的更少, 抑制骨吸收。除此以外, 唑來膦酸也能夠與羥基磷灰石結(jié)晶相融合, 影響骨骼表明吸附能力, 生物活性降低, 骨吸收量減少。

唑來膦酸和其他雙膦酸鹽能夠通過抑制破骨細胞活性來抑制骨質(zhì)流失。一些證據(jù)描述了輔助性T 細胞17(Th17)與M1 巨噬細胞之間的緊密相互作用, 但是這些相互作用是否參與唑來膦酸鹽介導(dǎo)的IL-17 增加尚不清楚。最近的研究表明, 細胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)可以抑制促炎性M1 巨噬細胞表型, 而SOCS3 缺乏則通過增加促炎性細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-12(IL-12)、白細胞介素-23(IL-23), 從而為Th1 和Th17 細胞的分化提供了微環(huán)境［6,7］。有趣的是, 唑來膦酸已被證明可以誘導(dǎo)M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)趨向M1 型, 并通過抑制巨噬細胞中SOCS3 的表達來增強促炎性細胞因子的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)可以解釋唑來膦酸至少部分通過促進M1 巨噬細胞極化和激活來驅(qū)動Th17 分化的機制。然而, 值得注意的是, 微生物菌群及其生物膜是頜骨壞死(ONJ)的共同特征, 也可能影響巨噬細胞和Th17 細胞的分化和功能。需要通過進一步的研究來描述唑來膦酸和口腔微生物菌群如何能夠共同或獨立地調(diào)節(jié)ONJ 中Th17、M1/M2 巨噬細胞和其他類型免疫細胞之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。

除唑來膦酸外, 最近的臨床試驗還報道了用地諾單抗治療的患者, 該藥物是針對骨質(zhì)疏松癥和某些癌癥患者普遍指定用作抗吸收藥的抗核因子κB(NF-κB)配體的人類受體激活劑的單克隆抗體(RANKL)。越來越多的證據(jù)表明, 在腫瘤微環(huán)境中激活M1 巨噬細胞可以促進炎癥反應(yīng), 將其作為癌細胞免疫監(jiān)視的機制［8-10］。具有M2 巨噬細胞特征的腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)可以抑制免疫反應(yīng)并促進腫瘤細胞的血管生成和轉(zhuǎn)移, 從而促進癌癥進展或減輕炎癥, 并促進傷口愈合。最近, 體外和體內(nèi)研究均表明, TAM 可能是雙膦酸鹽類藥物的潛在靶標, 可能是通過操縱腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞表型來實現(xiàn)的, 并且通過類似機制, 炎癥持續(xù)時間延長, 導(dǎo)致炎癥加劇。對于接受大劑量靜脈內(nèi)雙膦酸鹽預(yù)防和治療骨骼相關(guān)并發(fā)癥的癌癥患者,使用其他抗腫瘤藥物［包括糖皮質(zhì)激素(地塞米松)］、化療藥和(或)抗血管生成藥會帶來額外的風險。因此,應(yīng)進一步探討雙膦酸鹽和這些抗腫瘤藥是否對免疫系統(tǒng)有任何協(xié)同作用, 特別是對Th17 細胞和M1/M2 巨噬細胞之間的相互作用有影響, 因為這些免疫細胞可能起“雙刃”劍的作用, 會在腫瘤微環(huán)境中增強抗腫瘤免疫力和炎癥反應(yīng)。這種機制無意中導(dǎo)致了炎癥的延長, 從而延遲了愈合或表現(xiàn)為BRONJ 的骨壞死。

綜上所述, 雙膦酸鹽類藥物會對區(qū)域骨代謝加速過程中巨噬細胞極化狀態(tài)造成影響, 臨床應(yīng)用時需要加以重視。