響應面優化法在繡球菌液體菌種培養中的應用

賀立虎 王文光 李娟麗

摘要 為獲取生物活性高的繡球菌液體培養菌種，采用響應面優化法對液體培養條件進行了優化，以菌絲生物量為指標，建立了菌絲生物量與培養pH、溫度、裝瓶量的數據模型，得到了適宜的培養條件，即pH為4.5，培養溫度為23.9 ℃，裝液量為114 mL，在此培養條件下，菌絲生物量達5.9 g/L。

關鍵詞 繡球菌；菌絲生物量；響應面優化法

中圖分類號 S 646? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）23-0044-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.23.010

Application of Response Surface Optimization Method in Culture Conditions of Liquid Spawn of Sparassis crispa

HE Li-hu， WANG Wen-guang，? LI Juan-li

（Yangling Vocational & Technical College，Yangling，Shaanxi? 712100）

Abstract Response surface methodology （RSM） was used to optimize the culture conditions for obtaining high bioactivity Sparassis crispa species， and mycelial biomass was taken as the index， the data model of mycelium biomass， culture pH， culture temperature and culture volume was established， and the suitable culture conditions were obtained. The culture conditions were pH 4.5， culture temperature 23.9 ℃ and culture volume 114 mL， the mycelium biomass reached 5.9 g/L.

Key words Sparassis crispa;Mycelial biomass;Response surface optimization method

基金項目 楊凌職業技術學院2021年科技創新項目（ZK21-69）；陜西省2023年農業科技創新項目。

作者簡介 賀立虎（1980—），男，陜西合陽人，副教授，從事食用菌資源開發與利用研究。

收稿日期 2022-11-20

繡球菌（Sparassis crispa），又名繡球蕈、對花菌、干巴菌、椰菜菌、蜂窩菌等，為非褶孔菌目繡球菌科繡球菌屬。因其具有超高的激活免疫能力，在日本有“夢幻神奇菇”之稱。因其含有多種生物活性物質，尤以β-葡聚糖含量最高［1］，使其具有抗腫瘤［2］、增強免疫力［3］、保護胃黏膜、抗氧化［4］、抗衰老［5］、促進傷口愈合［6］、提高造血功能［7］等多重保健功效，在保健品市場和化妝品領域受到了追捧［8］。

繡球菌生長對環境要求嚴格，生長周期長，野生資源產量遠不能滿足市場的需求。經過大量的研究，近年來已經實現了人工栽培。筆者通過響應面優化法研究pH、培養溫度、裝瓶量，旨在為獲取生物活性高的繡球菌液體培養菌種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

將繡球菌母種（閩秀1號）接種于固體培養基（新鮮松針250 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，瓊脂粉15 g，水1 000 mL）［9］上，于25 ℃培養25 d。將培養后的繡球菌菌種定量接種于液體培養基（新鮮松針250 g，葡萄糖20 g，酵母膏10 g，瓊脂粉15 g，水1 000 mL）［7］，采用250 mL錐形瓶，每瓶按試驗設計進行定量裝樣，于150 r/min恒溫搖床上進行培養，每個處理設置3個平行，培養25 d，進行菌絲生物量的測定。

1.2 菌絲生物量的測定方法［10］

取恒溫培養25 d的液體培養基25 mL于離心機中在5 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，下層菌絲體用蒸餾水清洗3～4次，吸取表面水分，然后在恒溫干燥箱中于60 ℃條件下烘干至恒重，稱取重量計算每100 mL發酵液中的菌絲體生物量（g/L）。

1.3 中心組合設計（CCD）

依據pH、培養溫度和裝液量的單因素試驗結果，確定pH、培養溫度和裝液量的試驗范圍，以菌絲生物量為試驗指標，進行中心組合設計（CCD），對繡球菌液體菌種培養條件進行優化。試驗因素及水平見表1。

1.4 數據處理

試驗數據采用Excel 2020和Design Expert 11.0.1 軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 pH對菌絲生物量的影響。

由圖1可知，隨著pH的升高，菌絲生物量快速增加，當pH達到6左右時，菌絲生物量達到最大4.8 g/L，然后隨著pH的增加，菌絲生物量快速下降。pH過大或過小對菌絲生物量都有一定的抑制。

2.1.2 培養溫度對菌絲生物量的影響。

由圖2可知，溫度對菌絲生物量呈拋物線式的影響，在低溫區，隨著溫度的升高，菌絲生物量快速增加，當達到27 ℃左右時，菌絲生物量達到最大值5.3 g/L，隨后隨著溫度的繼續升高，菌絲生物量快速下降。此趨勢也符合溫度對微生物影響的一般規律。

2.1.3 裝液量對菌絲生物量的影響。

由圖3可知，在40～120 mL的裝液量時，隨著裝液量的增加，菌絲生物量也隨之增加，當裝液量在120 mL時，菌絲生物量達到最大為5.2 g/L，隨后隨著裝液量的增加，菌絲生物量略微降低。

2.2 回歸方程的建立及顯著性分析

依據中心組合設計（CCD）進行試驗，其結果見表2。

對表2的試驗結果進行統計分析，得到試驗指標與各因素之間的回歸方程模型（1）。

Y=0.530 4-0.068 4X1+0.046 4X2+0.038 5X3-0.043 7X1X2-0.038 7X1X3-0.063 7X2X3-0.042 8X21-0.025 1X22-0.028 7X23（1）

對回歸方程模型（1）以5%為置信區間進行顯著性水平分析，回歸方程模型、各因數顯著性檢驗結果見表3。

依據回歸方程顯著性要求，當方程顯著性為顯著，失擬性誤差為不顯著時，方程模型呈顯著性，即與實際試驗結果具有較好的擬合性。由響應面模型方差分析可知，該試驗回歸方程模型的F為17.77（判定值F（0.01，9，13）=4.19），呈極顯著性，失擬性誤差的F為2.677（判定值F（0.05，5，8）=3.69），呈不顯著，所以該回歸方程模型呈極顯著性。

在此回歸方程模型中，各因素X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X21、X22、X23的P值均小于0.05，表明各因素都呈顯著性。

預測擬合度R2為0.593 7，校正擬合度R2為0.872 8，預測擬合度≤校正擬合度，說明模型是合理的。信噪比值大于4 為理想值，該模型的信噪比為13.495 3，說明比值理想，可以被用來解釋設計方案。

2.3 最優試驗方案確定

依據二次項中心化組合設計，將因素水平帶入方程模型（1）中，可得因素水平回歸方程（2）。

Y=-2.245 46+0.239 838X1+0.094 825X2+0.193 91X3-0.003 646X1X2-0.000 646X1X2-0.000 354X2X1-0.010 702X21-0.000 698X22-0.000 032X23

（2）

由表3可知，各因素之間均有顯著的交互作用（P＜0.05），利用Design Expert 11.0.1軟件進行最優方案優化，當pH為4.5、培養溫度為23.9 ℃、裝液量為114 mL時，可以得到較好的菌絲生物量，依據方程模型（2）可以得到理論菌絲生物量為5.9 g/L（圖4～6）。

2.4 數學模型預測結果的驗證

在設定菌絲生物量Y=5.9 g/L的前提下，培養pH、培養溫度、裝液量都在試驗因素水平范圍內（4＜X1＜8，18＜X2＜30，60＜X3＜120），使菌絲生物量達到最大，通過數學模型對繡球菌液體菌種培養條件進行預測和優化，在Design Expert 11.0.1軟件中得出較優的解決方案，即理論預測菌絲生物量為5.9 g/L，此時pH為4.5，培養溫度為23.9 ℃，裝液量為114 mL，在此試驗條件下，連續做5次平行試驗，測得菌絲生物量平均值為5.8 g/L，與預測結果吻合度較好，說明利用響應面分析優化繡球菌液體菌種培養是可行的。

3 結論

該研究采用響應面優化法（CCD）對繡球菌液體菌種培養條件進行了優化，以菌絲生物量為指標，建立了繡球菌液體菌種培養與pH、培養溫度、裝液量3個因素的數據模型，用數據模型對菌絲生物量進行了預測，確定了最佳培養條件。在pH為4.5，培養溫度為23.9 ℃，裝液量為114 mL的培養條件下，菌絲生物量達5.9 g/L。

參考文獻

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