羊毛角蛋白融合型絲素蛋白膜材料的性能分析

常雪寧, 何海波, 王依辰, 曾 頔, 代方銀a,, 趙天福a,

(西南大學 a.資源昆蟲高效養殖與利用全國重點實驗室; b.蠶桑紡織與生物質科學學院;c.重慶市生物質纖維材料與現代紡織工程技術研究中心,重慶 400715)

蠶絲在中國已有幾千年的應用歷史,是自然界中唯一可以批量生產的天然長絲纖維,因其美麗的外觀而成為一種古老而令人向往的材料,在紡織等行業中具有重要意義。近年來,蠶絲的衍生材料蛋白質膜的研究備受關注,被應用于抗菌敷料[1]、骨修復支架[2-4]、緩釋載體[5]和生物傳感器[5-6]等領域,已成為前景美好的高科技材料。盡管原生蠶絲具有優越的機械性能,再生絲素膜的強度和韌性卻不盡如人意[7-8],這較大阻礙了其廣泛應用。為了增強再生絲素材料的機械強度,常向絲素原液中添加殼聚糖[5]、聚乙烯醇(PVA)[9]、水溶性聚氨酯[10]、海藻酸鈉[11]、甘油[12]等非蛋白成分。近年有學者將絲蛋白與羊毛角蛋白混合,成功制作強度改善的再生絲素材料[13]。甘油不僅可以增加材料的柔軟度和延展性,還可以促進絲素膜分子與水分子之間的相互作用從而改善親水性[14]。無論是添加蛋白質或非蛋白質的方法,往往都伴隨著溶解復雜、過程繁瑣、資源浪費和環境污染等問題。

羊毛角蛋白關聯蛋白(Keratin-Associated Proteins,KAPs)是羊毛纖維的主要結構成分,它在決定羊毛纖維的物理和機械性能方面起重要作用[15]。KAP中富含的半胱氨酸(11%～17%)能夠在氧化狀態下形成二硫鍵[16-18],交叉連接角蛋白分子中多肽鏈的不同區域,與疏水相互作用和范德華力一起賦予角蛋白高的機械強度和結構穩定性[19]。KAP被分成三個主要家族,其中KAP4和KAP5屬于超高硫角蛋白相關蛋白家族,其家族的半胱氨酸含量在所有羊毛角蛋白中最高[20]。KAP4.3中含有311個氨基酸,具有較長的半胱氨酸-絲氨酸富含區[21];KAP5.4富含甘氨酸和半胱氨酸,具有交替重復出現的長甘氨酸片段和短半胱氨酸片段[22]。

2000年首次成功將轉基因技術應用于家蠶[23],通過將外源基因轉入家蠶體內,可以得到具有特殊性能的優異蠶絲[24-25]。如果將外源蛋白質基因轉入家蠶,利用家蠶絲腺生產混合蛋白質,就可以省略以往生產融合再生蛋白質材料時難以回避的原料分別溶解后再混合等復雜繁瑣的過程。本實驗選用的材料是將羊毛角蛋白KAP4.3和KAP5.4基因轉入家蠶體內獲得的混合蛋白蠶絲,其中的二硫鍵[26-27],以及大量的α-螺旋和復合螺旋結構[28]可以增強蠶絲的機械性能,良好地將羊毛纖維的優良性能與蠶絲性能相結合,得到更高性能的絲纖維材料。本文將前述混合蛋白蠶絲溶解,先制作再生絲蛋白膜材料,然后探究該材料的結構和性能。

1 實驗材料與方法

1.1 材 料

普通家蠶繭(四川安泰絲綢公司)。轉基因蠶繭KAP4.3和KAP5.4(KAP型蠶繭)分別轉入了KAP4.3角蛋白(相對分子質量60 kDa)和KAP5.4角蛋白(相對分子質量39 kDa)[29]。

1.2 設備儀器

TG16-WS型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司),ALPHA傅里葉變換紅外光譜儀(德國布魯克),TD3500型X射線衍射儀(丹東通達科技有限公司),Phenom Pro型場發式掃描電子顯微鏡(荷蘭飛納公司),E44.104型電子萬能試驗機(美國美特斯工業系統(中國)有限公司),OCA15EC型光學接觸角測量儀(德國Dataphysics公司)。

1.3 絲素膜的制備

1.3.1 蠶繭脫膠處理

將三種蠶繭分別在98 ℃、浴比1︰100的0.5 g/L Na2CO3溶液中進行脫膠30 min,用去離子水洗凈,重復2次,得到脫膠蠶絲。

1.3.2 絲素膜的制備

取脫膠后的三種蠶絲以1︰10的浴比,分別放入三元溶液(三元溶液中CaCl2、H2O、C2H5OH的摩爾比為1︰8︰2)中,75 ℃加熱至完全溶解。將溶解后的絲素溶液用紗布過濾去除未溶物,濾液離心取上清液灌入透析袋(8 000～14 000 D)中,用去離子水透析脫鹽3 d,每隔4 h換水。將透析袋內的絲素溶液離心去除雜質后,調節質量分數為3%。

取三種絲素溶液各30 mL分別倒入90 mm塑料培養皿中,于60 ℃保溫緩慢去除水分,直至絲素膜成型。將得到的普通蠶絲絲素蛋白膜和KAP混合絲素蛋白膜分別命名為SF、KAP4.3-SF、KAP5.4-SF。另取三種絲素溶液各30 mL,分別加入1%甘油攪拌均勻,按上述方法制備絲素/甘油復合絲素膜,依次命名為SF/Gly、KAP4.3-SF/Gly、KAP5.4-SF/Gly。

1.4 絲素膜的結構和性能表征

1.4.1 FTIR光譜和X射線衍射圖譜分析

分別取膜樣品1 g剪成粉末,與KBr以1︰100混合,用瑪瑙研缽充分研磨,取適量粉末在壓片機中壓片,用ALPHA傅里葉變換紅外光譜儀進行檢測。檢測參數為4 000～500 cm-1的掃描范圍,32次的掃描次數,4 cm-1的分辨率。用PeakFit軟件對獲得紅外光譜的酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)進行分峰擬合并定量分析,計算6種膜樣品二級結構中的β-折疊、無規卷曲/α-螺旋和β-轉角的含量。

將膜樣品剪成2 cm×2 cm的方塊,用TD3500型X射線衍射儀對蠶絲進行結構表征,掃描波長為0.154 nm,2θ角的掃描范圍為5°～45°,掃描步長為0.02。

1.4.2 膜表面形貌的掃描電子顯微鏡觀察

將樣品放入烘箱中,100 ℃烘干24 h。然后按照要求修剪成適當尺寸,用導電膠粘貼在表面和截面樣品臺上,利用氮氣吹去樣品上的灰塵。在25 ℃條件下,利用真空濺射儀,在15 kV電壓下,濺射納米金90 s。在10 kV電壓、標準流束條件下,用PhenomPro型場發式掃描電子顯微鏡對膜的表面形貌結構進行觀察。通過調節掃描電鏡的放大倍數,得到清晰的膜表面形態圖像。

1.4.3 膜的機械性能測試

將蛋白膜剪成3 cm×1 cm的長方形,用游標卡尺檢測膜的厚度。再用E44.104型電子萬能試驗機以5 mm/min的速度進行拉伸測試,獲得5組平行數據。

1.4.4 蛋白膜的親疏水測試

利用OCA15EC型光學接觸角測量儀測量絲素蛋白膜表面的親疏水性。在25 ℃條件下,將薄膜樣品修剪成長寬為1 cm×1 cm方形樣品,并固定在光學接觸角測量儀的樣品臺上,采用去離子水為滴加液體,液滴體積為3 μL,液滴接觸薄膜樣品1 s后,記錄接觸角值,每組樣品重復測試3次,取其平均值。

2 結果與分析

2.1 蛋白膜的二級結構

對6種蛋白膜分別進行紅外光譜測試,結果如圖1所示。在測試波長范圍內,蛋白質分別在1 700～1 600 cm-1(酰胺Ⅰ帶)、1 600～1 500 cm-1(酰胺Ⅱ帶)、1 350～1 200 cm-1(酰胺Ⅲ帶)出現酰胺基團的特征吸收,1 037 cm-1處為伯醇的C—O的對稱伸縮振動,是甘油的特征吸收峰。對酰胺Ⅰ帶進行分峰擬合(圖2),并對各材料的二級結構含量定量分析(表1),1 610～1 640 cm-1為β-折疊,1 640～1 650 cm-1為α-螺旋和無規卷曲,1 660～1 700 cm-1為β-轉角[30]。

表1 絲素膜的二級結構組成

圖1 絲素蛋白膜的FTIR光譜

由圖2(g)和表1可以看出,KAP4.3-SF、KAP5.4-SF兩種絲素膜的β-折疊較SF增加尤為明顯。這是因為在蛋白溶液轉變為固體膜的過程中,隨著水分的蒸發,蛋白分子鏈間氫鍵減少,在鏈內分子運動的作用下形成鏈內氫鍵,主要為α-螺旋和β-折疊結構。而隨著溫度的升高,蛋白的分子運動增加,使得無規卷曲和α-螺旋結構的蛋白分子之間的相互作用力變得不穩定,從而向著穩定的β-折疊結構發生轉變,β-折疊結構則能夠更穩定地存在于高溫環境下。羊毛角蛋白基因本身含有的α-螺旋使β-折疊的增加較為明顯[31]。加入甘油后,甘油能夠與蛋白分子形成氫鍵或水合作用,增強了絲素蛋白分子之間的相互作用,誘導了α-螺旋向穩定狀態的β-折疊發生轉變,使絲素膜的穩定性得到了提高、總體上表現出β-折疊含量增高、α-螺旋與無規卷曲含量降低的趨勢。

圖3為絲素蛋白膜的X衍射譜圖,絲素蛋白SilkⅠ結晶的X射線的衍射峰主要出現在16.3°、22.5°、28.2°,SilkⅡ結晶的衍射峰主要出現在20.2°、24.8°。

圖3 絲素蛋白膜的X射線衍射圖譜

由圖3(a)可以看出,未加入甘油改性時,蛋白膜的衍射峰主要在16.3°和22.5°的位置,這表明此時蛋白膜中主要以SilkⅠ結晶的α-螺旋結構為主,SilkⅡ結晶較少;加入甘油后蛋白膜中的α-螺旋結構向β-折疊發生轉變,衍射峰主要為20.2°、24.8°[32],此時蛋白膜中的結構主要為以β-折疊為主的SilkⅡ結晶。這是因為絲素蛋白鏈本身具有許多親水性的氨基酸殘基,而甘油的羥基也能提供氫鍵供這些殘基使用。在絲素蛋白溶液中,這些氫鍵的形成促進了部分無規卷曲結構轉變為α-螺旋結構,同時在高溫作用下,另一些無規卷曲結構和α-螺旋結構也朝著更穩定的β-折疊結構方向發生轉變,這與FTIR光譜的結果相似。

2.2 蛋白膜的表觀結構

絲素蛋白膜及甘油增塑絲素蛋白膜表面的掃描電鏡照如圖4所示。

圖4 絲素蛋白膜SEM照片

由圖4可以看出,普通絲素膜、轉基因絲素膜,以及1%甘油改性的兩種絲素膜的表面形態都比較透明且均勻光滑,外源蛋白的融入并沒有對絲素膜的表觀形態造成明顯影響。

2.3 蛋白膜的機械性能

利用E44.104型電子萬能試驗機在恒溫恒濕條件(20 ℃、65%)下對6種絲素膜進行應力應變測試,拉伸強度和拉伸應變值的分布情況如圖5所示,平均斷裂強度結果如圖6所示。與普通絲素膜相比,轉羊毛角蛋白KAP4.3和KAP5.4絲素膜具有較高的拉伸強度與拉伸應變。未加入甘油的KAP4.3絲素膜的平均拉伸強度,相比于普通絲素膜提高了125%,平均拉伸應變提高了44%;KAP5.4絲素膜的平均拉伸強度相比于普通絲素膜提高了83%,平均拉伸應變提高了71%。KAP型絲素膜的機械強度高于普通絲素膜,分析認為其原因是KAP型絲素內的羊毛角蛋白表現出羊毛纖維特征,使絲素結構中含有更多的無規卷曲與α-螺旋結構,在經過物理化學作用后,無規卷曲與α-螺旋轉變為構象較為穩定的β-折疊結構,增加了絲素膜的機械性能。對兩種羊毛角蛋白融合型蠶絲和普通蠶絲材料的氨基酸組成分析顯示,兩種羊毛角蛋白融合型蠶絲的半胱氨酸含量較普通蠶絲有所增加(數據未發表)。半胱氨酸是一種含有硫原子的氨基酸,它具有一個硫氫基和一個側鏈硫醇基。當兩個半胱氨酸的硫醇基在適當條件下接近時,它們之間就會發生氧化反應,形成一個強穩定的二硫鍵(S—S鍵),并牢固地連接在一起。因此推測,半胱氨酸的增加導致了絲纖維中二硫鍵的數目增加,二硫鍵數目越多,蛋白質分子構象就越穩定,性能也就越好。兩種KAP型絲素膜的機械性能增加趨勢不一樣,其中KAP4.3-SF的平均拉伸強度比KAP5.4-SF高,造成這種差異的原因分析認為主要是外源羊毛角蛋白的相對分子質量和表達量的不同。本實驗材料轉入的KAP4.3蛋白的相對分子質量為60 kDa,表達量為3%,而轉入KAP5.4蛋白的相對分子質量為39 kDa,表達量只有1%。通常,外源蛋白相對分子質量越大、表達量越高,材料的機械性能越好[33]。加入甘油后,所有絲素膜的拉伸應變都得到了顯著提高,還使三種材料在拉伸應變方面的差異變得更加明顯,相較于SF/Gly,KAP4.3-SF/Gly的拉伸應變提高了45%,KAP5.4-SF/Gly的拉伸應變提高了75%。共混甘油以后甘油取代了絲素蛋白膜中的水,使構象從不穩定的α-螺旋和無規卷曲中間狀態向穩定結構β-折疊轉變[34],推測外源KAP蛋白和甘油在改進蛋白膜韌性方面有相互促進的作用。此外,KAP4.3和KAP5.4的氨基酸序列并不相同,KAP4.3蛋白具有較長的半胱氨酸-絲氨酸富含區,而KAP5.4蛋白中有交替重復出現的長甘氨酸片段和短半胱氨酸片段,這與材料的機械性能是否有關,有待更詳細的實驗驗證。

圖5 絲素蛋白膜的拉伸強度和拉伸應變值的分布情況

圖6 絲素蛋白膜的拉伸強度和拉伸應變的平均值

此外,使用Excel軟件分別對每兩種材料的應力應變數據進行“方差分析:無重復雙因素分析”,發現材料之間的應力應變結果都具有顯著差異。

2.4 蛋白膜的親疏水性

接觸角是液體與試樣表面相互作用形成的夾角,是衡量材料親疏水性能的重要參數,角度大于90°時材料是疏水性,小于90°時則是親水性,且角度越小材料親水性越好。

通過接觸角測試可以發現(圖7),融入KAP基因的絲素膜的親水性小于純絲素膜,分析認為這是由于角蛋白中含有的二硫鍵表現出較強的穩定性使材料不易溶解[35]。轉入的外源蛋白KAP4.3中的親水性氨基酸多于KAP5.4[29],這使得KAP4.3-SF的親水性略高于KAP5.4-SF。甘油是一種常見的親水性多元醇增塑劑[36],含有較多的親水性基團,加入甘油后三種材料的親水性都明顯增強。其中,KAP4.3和KAP5.4增加幅度更大,顯示出羊毛角蛋白的轉入更有利于甘油性能的發揮。

注:圖中角度為相應樣品三次測試的接觸角平均值。圖7 絲素蛋白膜的接觸角測試

3 結 論

利用轉基因技術將羊毛角蛋白關聯蛋白基因(KAP)轉入家蠶體內,制備得到的轉基因絲素膜具有更穩定的二級結構、較高的斷裂強度。甘油可以顯著改善轉基因絲素膜的拉伸性能和親水性能。

運用轉基因方法制作KAP融入型絲素蛋白膜,與傳統方法制作混合膜時需要單獨溶解蠶絲和羊毛再混合的繁瑣過程相比,該方法具有相對簡便且更高效的優點,為蠶絲與羊毛等天然蛋白質的研究和利用提供了新的途徑和思路。

致 謝

本文中轉基因蠶繭KAP4.3和KAP5.4(KAP型蠶繭)蒙西南大學資源昆蟲高效養殖與利用全國重點實驗室趙愛春教授研究團隊惠贈,謹此致謝。

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