锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液中放化純度薄層色譜分析方法的建立

王 勇,梁 塑,崔曉艷,姜 華,張 云,楊 柳

(原子高科股份有限公司,北京 102413)

锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液(以下簡稱99mTc-MDP注射液)是較理想的骨顯像劑,用于早期診斷惡性轉移性骨腫瘤和原發性骨腫瘤,對移植骨的存活監測、診斷外傷性骨折、骨骼炎癥和代謝性骨病等均有重要價值[1-3]。放化純度是99mTc-MDP注射液的有效性控制指標之一[4],其高低決定了臨床診斷效果。影響放化純度的主要因素是放射性化學雜質的含量。注射用亞錫亞甲基二膦酸鹽(以下簡稱MDP藥盒)的一般組成為亞甲基二膦酸、還原劑(氯化亞錫/氟化亞錫等)、抗氧化劑(維生素C等)和pH調節劑等。MDP藥盒的99mTc標記原理為:高锝[99mTc]酸鹽被還原劑由Ⅶ價態還原到Ⅳ價態[5],與過量的亞甲基二膦酸發生絡合反應,室溫靜置一定時間,確保絡合反應充分進行。在標記過程中,還原劑不足的情況下,高锝[99mTc]酸鹽不能被完全還原,則可能存在的放射性化學雜質為游離高锝[99mTc]酸鹽,可致血液本底增高,并可能在甲狀腺胃黏膜等臟器中濃集;在還原劑足量的情況下,高锝[99mTc]酸鹽被還原,但未完全與亞甲基二膦酸發生絡合反應,則可能存在還原水解锝[99mTc](以下簡稱膠體锝[99mTc])放射性化學雜質,可分布在肝皮部位。另外,劉國正等[6]在1999年報道,在亞錫還原條件下,當pH<9時,維生素C與高锝[99mTc]酸鹽可能會形成五價配合物。放射性化學雜質的存在影響著藥物的體內分布和代謝,為了保證藥物診斷的有效性以及患者用藥的安全性,須嚴格對其放射性化學雜質高锝[99mTc]酸鹽、膠體锝[99mTc]、可能存在的锝[99mTc]維生素C絡合物進行控制[7-8]。因此,擬建立的放化純度分析方法應具有較好的專屬性,能實現99mTc-MDP注射液中放射性主峰锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽與各放射性化學雜質的有效分離。

對于99mTc-MDP注射液放化純度的控制,《中國藥典》2020年版(ChP2020)、《美國藥典》42-NF37版(USP42-NF37)和《歐洲藥典》10.0版(EP10.0)均采用雙體系的分析方法。EP10.0采用薄層色譜法,iTLC-SG色譜紙作為固定相、1 mol/L的醋酸鈉溶液和2-丁酮分別為體系一和體系二的展開劑。ChP2020和USP42-NF37均采用紙色譜法,氯化鈉注射液(0.90%氯化鈉溶液)和85%甲醇分別為體系一和體系二的展開劑。國內外藥典方法均為雙體系的分析方法,并且ChP2020和USP42-NF37中的體系一要求在充氮條件下進行,導致實驗過程耗時且繁瑣。基于此,本研究主要從篩選固定相和展開劑入手,開發一種專屬性強、操作簡便的分析方法,用于測定99mTc-MDP注射液的放化純度,并開展線性、耐用性、精密度等實驗,對建立的分析方法進行驗證。

1 實驗設備與材料

1.1 主要儀器

AR-2000放射性薄層掃描儀:美國BIOSCAN公司;XPR205/A電子天平:梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;CRC-55tR活度計:美國CAPINTEC公司。

1.2 主要試劑和耗材

氯化鈉注射液:石家莊四藥有限公司;氯化鈉淋洗液、高锝[99mTc]酸鈉注射液、锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液:原子高科股份有限公司;醋酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、氯化亞錫(SnCl2·2H2O)、甲醇、2-丁酮、維生素C:分析純,國藥集團化學試劑有限公司;水:自制二次蒸餾水。

聚酰胺-6薄層板:浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠;Whatman No.1層析紙:英國Whatman公司;iTLC-SG色譜紙:美國Agilent公司;硅膠G薄層板:MACHEREY-NAGEL公司。

MDP標準藥盒:波蘭POLATOM公司。

2 實驗方法

2.1 溶液的制備

2.1.1供試品溶液(99mTc-MDP注射液) 按高锝[99mTc]酸鈉注射液的放射性濃度,取4～6 mL注入MDP藥盒中,充分振搖,使藥盒完全溶解,靜置反應5 min以上,即得含锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽的供試品溶液。

2.1.2參考溶液 向一瓶MDP標準藥盒中加入2 mL含100～400 MBq的高锝[99mTc]酸鈉注射液,搖勻,靜置反應約15 min,即得含锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽的參考溶液。

2.1.3測試溶液1 取高锝[99mTc]酸鈉注射液適量,作為含高锝[99mTc]酸鹽的測試溶液1。

2.1.4測試溶液2 準確稱取10 mg的SnCl2·2H2O于西林瓶內,加入0.1 mL高锝[99mTc]酸鈉注射液,搖勻,靜置反應約15 min,即得含膠體锝[99mTc]的測試溶液2。

2.1.5測試溶液3 在10.0 g/L維生素C的10 mL溶液中用微量進樣器加入10.0 g/L SnCl2·2H2O溶液0.010 mL,用鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH為8.0。取出1 mL,用注射器加入少量高锝[99mTc]酸鈉注射液,充分振搖,靜置反應5 min以上,即得含維生素C與高锝[99mTc]酸鹽形成的五價配合物溶液[6]。

2.2 放化純度分析方法的建立

使用玻璃毛細管或微量進樣器取供試品溶液適量,點于固定相一端原點處,晾干,將固定相放入盛有展開劑的層析缸展開,待展開至溶劑前沿10 cm時,將固定相取出,晾干。測試溶液1、測試溶液2按照上述相同的分析方法進行實驗。之后置于放射性薄層掃描儀上掃描,記錄色譜圖,觀察供試品溶液中锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽的峰形以及與測試溶液1中高锝[99mTc]酸鹽、測試溶液2中膠體锝[99mTc]之間的分離度R(計算如公式(1))。并根據锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形和R值選擇合適的條件。

R=2×(d2-d1)/(W1+W2)

(1)

式中:d2為相鄰兩峰中后一峰與原點的距離,mm;d1為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離,mm;W1和W2為相鄰兩峰各自的峰寬,mm。

2.2.1固定相優化

(1) 以ChP2020和USP42-NF37收錄的分析方法中0.90%氯化鈉溶液和85%甲醇分別作為體系一和體系二的展開劑,固定相分別為聚酰胺-6薄層板、Whatman No.1色層紙、硅膠G板和iTLC-SG色譜紙。考察不同條件下锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形和R值。

(2) 以EP10.0收錄的分析方法中1 mol/L醋酸鈉溶液和2-丁酮分別作為體系一和體系二的展開劑,固定相分別為聚酰胺-6薄層板、Whatman No.1色層紙、硅膠G板和iTLC-SG色譜紙。考察不同條件下锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形和R值。

2.2.2展開劑優化 ChP2020、USP42-NF37和EP10.0收錄的分析方法中體系二展開劑為85%甲醇或2-丁酮,對放射性雜質高锝[99mTc]酸鹽的分離效果幾乎無差別。故對于展開劑的優化實驗主要針對體系一(即水相)進行,分別以0.90%氯化鈉溶液和1 mol/L醋酸鈉溶液為展開劑初設條件,以2.2.1節中最佳固定相為該部分實驗的固定相,設計以下兩組實驗。

(1) 展開劑分別為0.45%氯化鈉溶液、0.90%氯化鈉溶液、2.00%氯化鈉溶液、0.90%氯化鈉溶液(醋酸調pH為3.0)、0.90%氯化鈉溶液(醋酸調pH為10.0),考察不同條件下锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形和R值。

(2) 展開劑分別為1 mol/L醋酸鈉溶液、V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.1 mol/L醋酸溶液)=1∶1、V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(1 mol/L鹽酸溶液)=1∶1、V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.5 mol/L鹽酸溶液)=1∶1、V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.1 mol/L鹽酸溶液)=1∶1、V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.05 mol/L鹽酸溶液)=1∶1,考察不同條件下锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形和R值。

2.2.3分析方法專屬性 供試品溶液、參考溶液、測試溶液1、測試溶液2和測試溶液3按照2.2節中描述的分析方法進行實驗。之后置于放射性薄層掃描儀上掃描,記錄色譜圖,觀察供試品溶液和參考溶液中锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰形以及與測試溶液1中高锝[99mTc]酸鹽、測試溶液2中膠體锝[99mTc]、測試溶液3中锝[99mTc]維生素C絡合物之間的分離度R,供試品溶液與參考溶液的锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽放射性主峰峰形和Rf值應一致,供試品溶液的锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽放射性主峰與各放射性化學雜質峰的分離度R應大于1.0。

2.3 放化純度分析方法的驗證

按照ChP2020收錄的《9101分析方法驗證指導原則》[9]以及ICH指導原則《Q2(R1):分析方法論證:正文和方法學》的相關要求,對擬定分析方法進行線性及范圍、耐用性和精密度等項目的驗證。

2.3.1線性及范圍 取一批次99mTc-MDP注射液作為線性母液,其放射性濃度為21.2 mCi/mL,用微量注射器精密移取一定活度的99mTc-MDP注射液(放射性活度分別為1.06、2.12、5.3、10.6、15.9、21.2、31.8、42.4 μCi)作為線性點點樣于固定相上;然后再精密量取一定量的線性母液,用氯化鈉注射液稀釋至放射性濃度為0.54 mCi/mL,用微量注射器精密移取一定活度的99mTc-MDP注射液(放射性活度分別為0.027、0.054、0.135、0.27、0.405、0.54、0.81、1.08 μCi)作為線性點點樣于固定相上。晾干后,置于放射性薄層掃描儀上,測定并記錄放射性計數。考察放射性計數與放射性活度成比例關系的能力,并確定分析方法的測量范圍。

2.3.2耐用性 分別考察不同批次的固定相、實驗室環境溫度(10～30 ℃)、不同體積配比展開劑對99mTc-MDP注射液放化純度測定的影響。在以上條件下放化純度測定結果相對誤差應≤2.0%,分析條件的微小改變應對99mTc-MDP注射液放化純度測定無明顯影響。

2.3.3中間精密度 兩名實驗人員對同一批次99mTc-MDP注射液進行放化純度分析。供試品溶液展開晾干后置于放射性薄層掃描儀上測定;按照上述方法,每名實驗人員各平行實驗6次,共計12次放化純度測試結果,計算相對標準偏差,得到中間精密度,合格限度應≤2.0%。

2.3.4分析方法的比對 使用擬定分析方法與EP10.0[10]、ChP2020[11]和USP42-NF37[12]收錄的分析方法對至少三批次99mTc-MDP注射液的放化純度進行比對測定,測定結果的相對誤差應≤2.0%。

3 結果與討論

3.1 放化純度分析方法的建立

3.1.1固定相優化 以0.9%氯化鈉溶液和85%甲醇分別作為展開體系一和體系二的展開劑,對固定相優化后的結果列于表1;以1 mol/L醋酸鈉溶液和2-丁酮分別作為展開體系一和體系二的展開劑,對固定相優化后的結果列于表2。

表2 固定相優化實驗分析結果(2)Table 2 Analysis results in optimized experiment of stationary phases (2)

從表1和表2可以看出,兩組實驗中固定相為iTLC-SG色譜紙、硅膠G薄層板、Whatman No.1色層紙時,展開體系一或體系二存在锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽(簡稱99mTc-MDP)放射性主峰拖尾、放射性主峰與放射性化學雜質峰無法分離或分離效果差等情況;而固定相為聚酰胺-6薄層板,0.90%氯化鈉溶液或1 mol/L醋酸鈉溶液為展開劑時,99mTc-MDP放射性主峰均有拖尾現象,但實現了單體系展開條件下將放射性主峰與各放射性化學雜質峰的有效分離。考慮99mTc-MDP注射液為短半衰期藥物,單體系展開條件可以更快得到放化純度檢驗結果,更有利于產品的放行檢驗。故確定分析方法為單體系,固定相為聚酰胺-6薄層板。

3.1.2展開劑優化 以聚酰胺-6薄層板為固定相,對展開劑進行優化的結果列于表3。從表3的分析結果可以看出,以0.90%氯化鈉溶液或1 mol/L醋酸鈉溶液為展開劑,均能實現锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽放射性主峰與各放射性化學雜質峰的分離;以0.90%氯化鈉溶液為初設展開劑進行優化,改變氯化鈉的質量分數、使用醋酸調節展開劑的酸堿度,對99mTc-MDP注射液中锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽放射性主峰拖尾情況的改善程度不明顯;以1 mol/L醋酸鈉溶液為初設展開劑進行優化,其中展開劑為1 mol/L醋酸鈉溶液與0.1 mol/L醋酸溶液等體積混合時,放射性主峰拖尾情況也未得到改善;當展開劑為1 mol/L醋酸鈉溶液與不同濃度的鹽酸溶液等體積混合時,放射性主峰拖尾程度變輕,得到了明顯的改善;尤其是鹽酸溶液濃度為0.1 mol/L時,效果最佳,放射性主峰與各放射性化學雜質的分離度>1.0,放射性主峰拖尾程度進一步得到了改善,峰形良好。

表3 展開劑優化實驗分析結果Table 3 Analysis results in optimized experiment of developing solvent

3.1.3分析方法專屬性 通過固定相和展開劑的優化篩選實驗,擬定分析方法為:固定相為聚酰胺-6薄層板,展開劑為V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.1 mol/L鹽酸溶液)=1∶1。使用玻璃毛細管或微量進樣器取供試品溶液適量,點于固定相一端原點處,晾干,將聚酰胺-6薄層板放入盛有V(1 mol/L醋酸鈉溶液):V(0.1 mol/L 鹽酸溶液)=1∶1的溶液的層析缸展開,待展開至溶劑前沿10 cm時,將固定相取出,晾干;參考溶液、測試溶液1、測試溶液2和測試溶液3按照上述相同的分析方法進行實驗。之后置于放射性薄層掃描儀上掃描,各色譜圖示于圖1。圖1a和圖1b可以看出,供試品溶液和參考溶液色譜圖中锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽峰的峰形良好且幾乎一致,Rf均約為1.0。從圖1c、圖1d和圖1e可以看出,測試溶液1中高锝[99mTc]酸鹽、測試溶液2中膠體锝[99mTc]、測試溶液3中锝[99mTc]維生素C絡合物的Rf約為0。通過公式(1)計算出供試品溶液的锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽放射性主峰與各放射性化學雜質峰的分離度R均大于1.0,滿足要求。

a——供試品溶液; b——參考溶液; c——測試溶液1; d——測試溶液2; e——測試溶液3

3.2 放化純度分析方法的驗證

3.2.1線性及范圍 放射性計數與放射性活度的線性關系示于圖2。由圖2可知,當99mTc-MDP注射液的放射性活度在0.027～42.4 μCi范圍內時,99mTc-MDP注射液的放射性計數與放射性活度成線性關系,線性方程為y=8 791.451 15x+4 579.041 87,相關系數r=0.997,滿足r≥0.990的要求。

圖2 放射性計數與放射性活度的線性關系Fig.2 The linear relation of the radioactivity counts to the radioactivity

3.2.2耐用性 取不同批次聚酰胺-6薄層板按照擬定分析方法進行實驗,放化純度測定結果間的相對誤差為0.33%。在不同溫度實驗條件下,10 ℃和30 ℃展開時與室溫25 ℃展開時測定的放化純度結果的相對誤差分別為0.45%和0.94%。展開劑體積配比為V(1 mol/L醋酸鈉溶液)∶V(0.1 mol/L 鹽酸溶液)分別為0.8∶1(V/V)、0.9∶1(V/V)、1.1∶1(V/V)、1.2∶1(V/V)時,測定的放化純度結果與V(1 mol/L醋酸鈉溶液):V(0.1 mol/L 鹽酸溶液)=1.0∶1的相對誤差分別為0.36%、0.38%、0.53%、1.12%。以上放化純度測定結果的相對誤差均滿足≤2.0%的要求,說明分析條件的微小改變對99mTc-MDP注射液放化純度測定無明顯影響。

3.2.3中間精密度 兩名實驗人員對同一批次99mTc-MDP注射液進行放化純度分析。每名實驗人員各平行實驗6次,共計12次放化純度測試結果,所得Rf分別為0.973、0.974、0.974、0.929、0.943、0.966、0.982、0.980、0.981、0.937、0.973和0.973;放化純度分別為97.13%、97.07%、96.64%、95.84%、94.56%、96.69%、97.27%、96.93%、96.58%、96.20%、96.83%和97.35%,平均值為96.60%,相對標準偏差(RSD)為0.80%(n=12),滿足≤2.0%的要求,表明該方法的中間精密度良好。

3.2.4分析方法比對 使用擬定分析方法與EP10.0[9]、ChP2020[10]和USP42-NF37[11]收錄的分析方法對99mTc-MDP注射液的放化純度進行比對測定,詳細結果列于表4和表5。從表4可以看出,四批次99mTc-MDP注射液,本方法測定放化純度的平均值為97.03%,《中國藥典》[10]/《美國藥典》[11]測定放化純度的平均值為97.06%,兩種方法測量結果的相對誤差為0.03%。從表5可以看出,四批次99mTc-MDP注射液,本方法測定放化純度的平均值為98.17%,歐洲藥典測定放化純度的平均值為97.92%,兩種方法測量結果的相對誤差為0.26%。通過擬定方法與各國藥典方法的比對結果看,測量結果的相對誤差均滿足≤2.0%的要求,說明本方法具有較好的準確性。

表4 99mTc-MDP注射液的放化純度測量結果比對(1)Table 4 Comparison of radiochemical purity measurements of 99mTc-MDP injection (1)

表5 99mTc-MDP注射液的放化純度測量結果比對(2)Table 5 Comparison of radiochemical purity measurements of 99mTc-MDP injection (2)

4 結論

本研究建立了一種用于99mTc-MDP注射液放化純度檢測的薄層色譜分析方法,即以聚酰胺-6薄層板為固定相,V(1 mol/L醋酸鈉溶液):V(0.1 mol/L鹽酸溶液)=1∶1為展開劑。并對該分析方法進行了專屬性、線性、耐用性、精密度等方法學驗證,驗證結果均符合要求。該分析方法可實現放射性主峰與各放射性化學雜質峰的有效分離,分離度>1.0,并且明顯改善了放射性主峰拖尾的情況,峰形良好。因此,該分析方法可用于99mTc-MDP注射液的放化純度測定。