基于液相色譜-同位素稀釋質譜法測定氨基酸的蛋白質定量方法

李永利,高艷秋,薛民杰,郝玉紅,李 杰

(上海市計量測試技術研究院,上海市在線檢測與控制技術重點實驗室,上海 201203)

蛋白質是生命體實現生理功能的直接參與者,因此研究生命體蛋白質表達模式和功能作用不僅局限于蛋白質的定性分析,臨床檢測、食品分析等領域對蛋白質的定量測量需求越來越強烈。常用的蛋白質定量測量方法主要有電泳法[1]、免疫法[2-3]、高效液相色譜[4]和液相色譜-質譜聯用法[5]等,隨著質譜分析技術的發展,被認為是小分子定量金標準的同位素稀釋質譜法[6-7]應用于蛋白質定量測量中,展現了準確、精密、易于溯源等特點[8-9]。

基于同位素稀釋質譜法的蛋白質定量技術,可以將蛋白質酶解成肽段后測定特征肽段進行定量,也可以將蛋白質完全水解成游離氨基酸后,測定各氨基酸含量,再根據蛋白質的氨基酸序列信息,由氨基酸含量計算得到蛋白質含量。基于肽段的定量方法具有更好的特異性,但需要設計酶解方案、合成標記的特征肽段,難以建立具有普適性的定量方法;基于氨基酸的定量方法,不僅需要獲得準確的氨基酸序列信息,而且為了避免游離氨基酸和雜質蛋白、肽段水解產生氨基酸對測量結果的干擾,需要預先提純蛋白質,但該方法易于建立測量結果的計量溯源性,實現對蛋白質的絕對定量,且可以建立適用于不同蛋白質的樣品處理和儀器分析方法,和傳統氨基酸分析法相比操作簡單、準確度和精密度高[8],和基于肽段的定量方法相比通用性更強,因此應用于蛋白質含量測定國際比對[10]、蛋白質標準物質研制[11-12]和臨床診斷中各種蛋白質分析的校準[13-14],建立蛋白質分析的計量溯源性。

本研究采用蛋白質水解后以同位素稀釋質譜法測定氨基酸含量的方式,建立可用于多種蛋白質的高準確度定量方法,方法精密、靈敏,結果可溯源至國際基本單位,可應用于蛋白質絕對定量和蛋白質標準物質研制。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀:Acquity UPLC I-Class Plus/XEVO TQ-XS型,美國Waters公司;電子天平:XPE105型,瑞士Mettler Toledo公司;超純水儀:Milli-Q型,德國Merck公司;水燃料氫氧機:OH200型,湖南沃克能源科技有限公司;強制對流烘箱:FD115型,德國Binder公司;冷凍干燥機:L-200型,瑞士Buchi公司。

GBW(E)100084脯氨酸純度標準物質(Pro,99.0±1.5%,k=2)、GBW09236 L-纈氨酸純度標準物質(Val,99.4%,Ur=0.6%,k=2)、GBW09237 L-亮氨酸純度標準物質(Leu,99.7%,Ur=0.4%,k=2)、GBW09238 L-異亮氨酸純度標準物質(Ile,99.7%,Ur=0.3%,k=2)、GBW(E)100061苯丙氨酸純度標準物質(Phe,99.0±1.5,k=2)等20種天然氨基酸純度標準物質和GBW(E)091110 新型冠狀病毒核衣殼蛋白(N蛋白)人源IgG單克隆抗體溶液標準物質(85.3±8.5 μg/g):中國計量科學研究院;Pro-13C5、Val-13C5、Leu-13C615N、Ile-13C6、Phe-13C9:純度>98%,豐度>99 atom%,美國CIL公司;甲酸、乙腈:質譜純,德國Merck公司;全氟戊酸:純度>97%,德國Merck公司。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1氨基酸標準儲備液 為了獲得更高準確度的定量結果,采用重量法配制標準溶液。分別稱取Pro、Val、Leu、Ile、Phe標準物質約10 mg至不同的10 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,稱量并記錄溶液總重,得濃度約為1 000 μg/g的氨基酸標準儲備液。

1.2.2氨基酸混合標準中間液 分別稱取Pro、Val、Leu、Ile、Phe儲備液適量至10 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,稱量并記錄溶液總重,得氨基酸混合標準中間液。

1.2.3內標物標準儲備液 分別稱取Pro-13C5、Val-13C5、Leu-13C615N、Ile-13C6、Phe-13C9約10 mg至不同的10 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,稱量并記錄溶液總重,得濃度約為1 000 μg/g的內標物標準儲備液。

1.2.4內標物混合標準中間液 分別稱取Pro-13C5、Val-13C5、Leu-13C615N、Ile-13C6、Phe-13C9儲備液適量至10 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,稱量并記錄溶液總重,得內標物混合標準中間液。

1.2.5標準工作液 分別移取氨基酸混合標準中間液、內標物混合標準中間液9 μL、10 μL至樣品瓶中并準確稱重,冷凍干燥至干后用0.1%甲酸水溶液500 μL復溶,得低濃度標準工作液。

分別移取氨基酸混合標準中間液、內標物混合標準中間液11 μL、10 μL至樣品瓶中并準確稱重,冷凍干燥至干后用0.1%甲酸水溶液500 μL復溶,得高濃度標準工作液。

1.3 儀器分析條件

1.3.1色譜條件 Hypercarb多孔石墨碳色譜柱(100×2.1 mm,3 μm);柱溫40 ℃;流動相:A為0.1%(體積分數,下同)全氟戊酸水溶液,B相為乙腈;梯度洗脫:0～5 min使流動相A由100%降至90%,5～10 min使流動相A由90%降至0%后保持至11.5 min,再將流動相恢復至初始比例平衡1.5 min;流速:0.3 mL/min;進樣量:2 μL。

1.3.2質譜條件 電噴霧正離子源(ESI+),毛細管電壓3.0 kV,離子源溫度,150 ℃,脫溶劑氣流速1 000 L/h,脫溶劑氣溫度500 ℃,錐孔氣流速150 L/h,碰撞氣為氬氣,多反應監測(MRM)模式。其他質譜條件列于表1,其中*為定量離子。

表1 氨基酸分析質譜參數Table 1 MS parameters for amino acids

1.4 蛋白質的水解

準確稱取適量樣品至清洗干凈的2 mL棕色安瓿瓶,再移入內標物混合標準中間液10 μL并準確稱重,加入6 mol/L的鹽酸水溶液600 μL,通氮氣1 min后融封,在130 ℃烘箱中水解15 h。水解后冷凍干燥至干,用0.1%甲酸水溶液500 μL復溶,進LC-MS/MS分析。

1.5 蛋白質含量計算

采用括號法測定各氨基酸含量,即以低濃度標準工作液-樣品-高濃度標準工作液-樣品-低濃度標準工作液進樣測試,按公式(1)分別由各氨基酸含量計算蛋白質含量:

(1)

式中,Cx為由某氨基酸計算得到的蛋白質濃度,μg/g;Rs、Rl、Rh分別為樣品、低濃度和高濃度標準工作液中氨基酸和內標物的峰面積比;mSTDl、mIl和mSTDh、mIh分別為低濃度和高濃度標準工作液配制時加入氨基酸混合標準中間液、內標物混合標準中間液的質量,mg;cSTD為混合標準中間液某氨基酸的濃度,μg/g;mSI為蛋白質水解前加入內標物混合標準中間液的質量,mg;ms為樣品質量,mg;n為蛋白質中某氨基酸的數量;MAA、MN分別為某氨基酸、蛋白質的摩爾質量,g/mol。

各氨基酸含量計算得到的蛋白質量分數結果,經正態性檢驗、一致性和等精度檢驗后的算術平均值或加權算數平均值即為蛋白質含量結果。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

用0.1%甲酸水溶液分別配制濃度為100 ng/mL的20種天然氨基酸標準溶液和內標溶液,以連續流直接進樣的方式注入質譜儀中進行全掃描,以響應最高的準分子離子峰質荷比作為母離子,優化錐孔電壓等各質譜參數使母離子信號強度最高。再對母離子分別進行子離子掃描,選擇信號強度最高且穩定的離子對作為定量離子對和定性離子對,優化碰撞能量使子離子信號強度最高。優選的質譜條件和特征離子對列于表1。

2.2 色譜條件優化

由于氨基酸極性較強,C18色譜柱上不易保留,分離效果不佳,常通過柱前衍生[15]降低極性或者使用親水作用(Hilic)色譜柱[16]改善分離,但分析效率和分離效果難以滿足蛋白質定量分析的要求。本研究結合多孔石墨化碳填料(Hypercarb)和揮發性離子對試劑,高效、準確、精密的實現了20種天然氨基酸的分離分析(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸),除His、Arg、Trp外絕大多數氨基酸峰型對稱、尖銳,質譜響應靈敏。

2.3 定量氨基酸選擇

由單一氨基酸含量計算蛋白質含量結果,因受蛋白質純度、水解過程、測量誤差等眾多因素影響,難以保證準確度。而由多個氨基酸含量統計計算的蛋白質含量,可以降低雜蛋白、氨基酸水解差異和偶然因素引入的誤差,獲得更為準確的蛋白質定量結果。但實驗表明,經過1.4節的水解步驟后,Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Glu、Met、Tyr、Trp等氨基酸會發生不同程度的降解。因此綜合考慮各天然氨基酸的耐酸性、熱穩定性和所建立定量分析條件下的準確性、精密度,結合蛋白質中氨基酸的含量差異,選擇Pro、Val、Leu、Ile、Phe作為定量蛋白質的氨基酸。

2.4 水解條件優化

水解條件優化結果示于圖1。水解需要在保證氨基酸未被降解的前提下盡可能將蛋白質完全轉化成游離氨基酸,而水解效率受水解試劑和濃度、水解溫度、水解時間等因素影響,因此,本研究使用肌紅蛋白(Mb)、人血清白蛋白(HSA)和C-反應蛋白(CRP)優化水解條件。

a——鹽酸濃度; b——水解溫度; c——水解時間

蛋白質水解方法主要有酸水解、堿水解、酶水解和微波消解等,堿水解容易使部分氨基酸消旋化,酶水解往往需要較長的時間,酸水解通用、高效的特點使其成為采用較多的水解方法[17]。酸水解最常用的水解試劑是鹽酸和甲磺酸,因為甲磺酸難易揮發,水解后難以去除,會干擾質譜檢測,因此選擇鹽酸作為水解試劑。通過對不同濃度的鹽酸考察表明,濃度小于4 mol/L水解效率不足,濃度大于6 mol/L水解后氨基酸含量基本一致(圖1a);通過對不同水解溫度的考察表明,高于100 ℃的水解溫度可以顯著提升水解效率,130 ℃ 和150 ℃水解后氨基酸含量沒有顯著差異(圖2a);通過對水解時間的考察表明,3種蛋白質水解15 h后氨基酸含量沒有顯著增加(圖3a)。因此,以6 mol/L的鹽酸水溶液作為水解試劑、通氮氣融封后在130 ℃水解15 h是優選的水解條件。

圖2 新冠病毒N蛋白測定的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of COVID-19 N protein determination

2.5 線性范圍和檢出限

分別移取一定量的 Pro、Val、Leu、Ile、Phe和Pro-13C5、Val-13C5、Leu-13C615N、Ile-13C6、Phe-13C9儲備液,配制氨基酸濃度為10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL,內標濃度為100 ng/mL的標準系列工作液。經LC-MS/MS分析后,以氨基酸和相應內標的濃度比為橫坐標、峰面積比為縱坐標,繪制回歸方程,分別以信噪比3和10計算檢出限和定量限,結果列于表2。5種氨基酸在10～1 000 ng/mL范圍內線性關系良好,線性相關系數均大于0.995,檢出限范圍為0.02～0.07 ng/mL,定量限范圍為0.06～0.2 ng/mL。

表2 5種氨基酸的回歸方程、相關系數、檢出限、定量限Table 2 Regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of 5 amino acids

2.6 回收率和精密度

稱取適量標準中間液,加入棕色安瓿瓶的5種氨基酸質量分別為25 ng、50 ng和100 ng,按1.4節步驟處理,每個水平平行處理3份。經LC-MS/MS分析后,結果表明,3個不同質量水平下5種氨基酸的回收率在97.0%～102.4%之間,相對標準偏差在1.1%～3.0%之間。

2.7 檢測應用

新冠病毒N蛋白測定的總離子流圖示于圖2。采用本研究所建立的方法,測定GBW(E)091110 新型冠狀病毒核衣殼蛋白(N蛋白)人源IgG單克隆抗體溶液標準物質的含量,由Val、Leu、Ile、Phe測得含量計算的抗體濃度分別為82.30、84.60、84.10、85.10 μg/g,4種氨基酸含量計算的抗體濃度符合正態分布,且結果一致、等精度,因此抗體濃度為84.0 μg/g。測定結果在標準物質證書給出的標準值(85.3±8.5) μg/g范圍內,En值0.14<1,表明測定結果與標準物質的標準值相一致。

采用本研究所建立的方法,參加了“新冠病毒N蛋白同位素稀釋質譜法測量能力”國家計量比對,測量結果與主導實驗室等效一致,比對結果符合要求。

3 小結

本研究采用同位素稀釋質譜法建立了20種天然氨基酸的分析方法,通過對蛋白質水解液中5種氨基酸準確、精密、靈敏的定量分析,實現了高準確度的蛋白質定量測量,測量結果可溯源至國際基本單位。該方法測量新冠病毒N蛋白人源IgG單克隆抗體有證標準物質的結果與標準值一致,采用該方法參加新冠病毒N蛋白國家計量比對的測量結果滿意,證明該方法對多種不同蛋白含量測定均具有足夠的準確性,可作為通用方法應用于蛋白質標準物質的研制和臨床診斷、食品安全中各種蛋白質分析的校準,建立蛋白質分析的計量溯源性。