蒲公英中綠原酸的提取工藝優化及穩定性研究

劉軍海 ， 苗僑偉， 何 敏

（1.陜西理工大學化學與環境科學學院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學陜西省催化基礎與應用重點實驗室，陜西 漢中 723001）

蒲公英又名婆婆丁， 是菊科多年生草本植物，廣泛生于山坡草地、路邊、田野、河灘（劉光武，2022；劉曉燕，2022）。 蒲公英營養成分豐富，可作為野生蔬菜食用， 也是一味重要的臨床常用草藥（秦聰聰，2022），主要含有黃酮類、多糖類、色素類、有機酸類物質（趙欣，2022）。 其資源豐富，來源廣泛，價格低廉，其中酚酸類物質種類豐富，尤其是蒲公英葉中綠原酸含量較高（馮戲雨，2019），臨床報道其具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、降血糖和免疫調節等多方面的藥理作用 （高林曉，2022；Bagdas，2020；Naveed，2018；Li，2010）。 近年來，蒲公英在食品、藥品、化妝品等領域的研究也在不斷深入，隨著國家禁止在飼料中添加抗生素類藥物等相關政策的發布，尋找天然來源、低毒低殘留、成本低廉的抗生素類產品已成為目前畜牧養殖中的重點（劉靜慧，2020）。

本研究以陜西漢中野生蒲公英為原料， 采用超聲波輔助醇水溶液提取綠原酸， 以綠原酸得率為考察指標，在單因素試驗的基礎上，設計正交試驗，探究綠原酸提取的最佳條件，并對所得綠原酸提取液進行體外抗氧化活性探究及穩定性研究，旨在為蒲公英開發成安全穩定的功能性飼料提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 蒲公英（陜西漢中野生）；無水乙醇（AR， 利安隆博華有限公司）； 維生素C 片（AR，四川依科制藥有限公司）；無水碳酸鈉（AR，成都市科龍化工試劑廠）；氯化鈉（AR，天津市科密歐化學試劑有限公司）；葡萄糖（AR，天津市科密歐化學試劑有限公司）；硫酸銅（AR，天津博迪化工股份有限公司）；硫酸鋅（AR，天津市大茂化學試劑廠）；硫酸亞鐵（AR，天津市大茂化學試劑廠）；硫酸鐵（AR，天津市大茂化學試劑廠）；山梨糖醇（食品級，壽光市華力糖醇有限公司）；焦亞硫酸鈉（食品級， 恒億化工有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（≥98%，阜陽生物技術有限公司）；雙氧水（AR，西安龍泰化工材料有限公司）；綠原酸標準品（AR，南京源植生物科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器 LD5-10 低速離心機（北京京立離心機有限公司）；TU-1900 型雙光束紫外可見分光光度計 （濟寧市裕澤工業科技有限公司）；GW1030 超聲波清洗機型（深圳市冠博科技實業有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠原酸標準曲線的繪制 準確稱取5.5 mg的綠原酸標準品于小燒杯中，加入適量無水乙醇，超聲輔助至完全溶解后轉移至100 mL 容量瓶中， 用無水乙醇定容至刻度線作為綠原酸標準品溶液。 經雙光束紫外可見分光光度計測定綠原酸標準液的最大吸收波長為326 nm，分別移取綠原酸標準溶液1、3、5、7、9 mL 于10 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容后靜置15 min。 使用無水乙醇作為空白對照組在326 nm 處測定其吸光度， 每組平行測定3 次，求取平均值。以綠原酸標準液的吸光度A 為縱坐標，以綠原酸標準液的濃度C 為橫坐標，做出C-A 關系圖。

1.2.2 綠原酸的提取及測定 將蒲公英全草洗凈，放入烘箱干燥至恒重， 用中草藥粉碎機粉碎后過50 目篩網得蒲公英全草粉末， 放入棕色磨口瓶中備用。準確稱取蒲公英全草粉末1.00 g 于干燥試管中，按照料液比為1:14（g/mL）加入體積分數為50%的乙醇水溶液， 搖勻后在60 ℃條件下放入600 W超聲波清洗機超聲輔助提取1 h， 將試管中的液體移入離心管設置轉速（3000 r/min）離心20 min 后減壓抽濾并量取上層清液體積并記錄。 移取1 mL清液稀釋50 倍后在326 nm 處測定其吸光度，根據1.2.1中所得線性方程求出提取液濃度。 以綠原酸標準品為對照品，計算蒲公英中綠原酸的提取率。

式中：C 為超聲后的提取液濃度，μg/mL；V為離心后的上層清液的體積，mL；n 為稀釋倍數；m 為稱取的蒲公英葉粉末的質量，g。

1.2.3 綠原酸提取的單因素試驗設計

1.2.3.1 提取料液比的篩選用50%的乙醇水溶液為提取溶劑， 分別設置料液比1:11、1:12、1:13、1:14、1:15（g/mL），按照“1.2.2”的方法條件進行提取， 探究不同提取料液比對蒲公英綠原酸得率的影響。

1.2.3.2 提取時間的篩選 分別設置提取時間0.5、1、1.5、2、2.5 h，按照“1.2.2”的方法條件進行提取，探究不同提取時間對蒲公英綠原酸得率的影響。

1.2.3.3 提取溶劑體積分數的篩選 分別配制體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液作為提取溶劑，按照“1.2.2”的方法條件進行提取， 探究不同提取溶劑體積分數對蒲公英綠原酸得率的影響。

1.2.3.4 提取溫度的篩選 分別設置溫度為40、50、60、70、80 ℃，按照“1.2.2”的方法條件進行提取，探究不同提取溫度對蒲公英綠原酸得率的影響。

1.2.4 正交試驗設計 以提取料液比（A），提取時間（B），提取溶劑體積分數（C），提取溫度(D)為主要影響因素，空白列（E）為誤差列，以綠原酸得率為考察指標，進行L16（45）正交試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 L16（45) 正交試驗因素水平

1.2.5 體外抗氧化性檢測分析

1.2.5.1 DPPH 自由基清除法準確稱取DPPH 4.5 mg 于燒杯中，加入50%的乙醇水溶液使其充分溶解，轉移至25 mL 容量瓶中定容，該溶液現配現用，密封避光保存。 將綠原酸提取液和維生素C 分別稀釋配成0.12、0.24、0.3、0.48、0.6 μg/mL系列的溶液。在10 mL 試管中分別加入2.0 mL 綠原酸提取液，2 mL DPPH 溶液，再加2 mL 的50%乙醇溶液，混勻，用1 cm 的比色皿在517 nm 波長處測定吸光度，記為Ai；再放入柜子避光保存0.5 h后再次測量吸光度，記為Aj；對照組試驗只加2 mL的DPPH 溶液，再加4 mL 的50%乙醇溶液，其吸光度記為AC（參比溶液為50%乙醇溶液）。每個樣品測定三次，求取平均值。 在同等條件下，測定維生素C 對DPPH 清除的能力（馬萌，2022）。

1.2.5.2 羥基自由基清除法 準確稱取H2O2試劑4.5 mg 于燒杯中， 將其轉入50 mL 容量瓶中，用50%乙醇水溶液定容，備用。 將綠原酸提取液和維生素C 分別稀釋配成0.12、0.24、0.3、0.48、0.6 μg/mL 系列的溶液。 在10 mL 試管中分別加入2.0 mL 綠原酸提取液，2 mL H2O2溶液，再加2 mL 的50%乙醇溶液，混勻，然后用1 cm 的比色皿在326 nm 波長處測定吸光度，記為Ai；再放入柜子避光保存0.5 h 后再次測量吸光度，記為Aj；對照組試驗只加2 mL 的H2O2溶液， 再加4 mL的50%乙醇溶液，其吸光度記為AC（參比溶液為50%乙醇溶液）。每個樣品測定三次，求取平均值。在同等條件下，測定維生素C 對H2O2羥基自由基清除的能力（王凱，2021）。

1.2.6 穩定性研究

1.2.6.1 金屬鹽離子對于綠原酸穩定性的影響分別取7 份10 mL 綠原酸提取液于50 mL 燒杯中，向其中6 個燒杯分別加入1.00 g 的不同金屬鹽Na+（a）、K+（b）、Zn2+（c）、Cu2+（d）、Fe2+（e）、Fe3+（f），剩余一個作為空白對照。

1.2.6.2 pH 對于綠原酸穩定性的影響分別取7 份10 mL 綠原酸提取液于50 mL 燒杯中， 用1 mol/L 的稀硫酸和無水碳酸鈉分別調節其pH，將pH 為7 作為空白對照，檢測并記錄其吸光度。

1.2.6.3 食品添加劑對于綠原酸穩定性的影響分別取4 份10 mL 綠原酸提取液于50 mL 燒杯中，分別向其中3 個燒杯中加入1.00 g 不同的食品添加劑，剩余一個空白對照，檢測并記錄其吸光度。

2 結果與分析

2.1 綠原酸的標準曲線 由圖1 可以看出， 吸光度與質量濃度呈線性關系， 得出方程式為y=0.07965x+0.04055，R2=0.9998，表明線性關系良好。

圖1 綠原酸標準液C-A 關系圖

2.2 綠原酸提取的單因素試驗結果

2.2.1 提取料液比對蒲公英綠原酸得率的影響由圖2 可以看出，隨著提取料液比的增加，綠原酸的提取率先增大后減小。 當提取料液比為1:14（g/mL）時，蒲公英中綠原酸的提取量達到最大值。 而出現提取率先增大后減小的趨勢可能是因為當提取溶劑較少時，蒲公英中的綠原酸沒有完全浸出，而當提取溶劑過大時， 蒲公英中的其他活性物質例如黃酮、色素等也被浸出，造成綠原酸提取率略有減小。料液比增大會造成溶劑用量大，生產成本高而且影響后續對于蒲公英綠原酸提取液中綠原酸含量的測定與判斷。綜上所述，初步選擇的料液比水平為1:14（g/mL）。

圖2 提取料液比對綠原酸得率的影響

2.2.2 提取時間對蒲公英綠原酸得率的影響由圖3 可以看出，隨著提取時間的增加，綠原酸的提取率呈現先增大后減小的過程，可以直觀看出，綠原酸提取率與提取時間之間的關系有一個峰值，即超聲振蕩時間為1.5 h 時，綠原酸提取率達到最高。 而出現提取率先增大后減小的趨勢可能是當提取時間小于1.5 h 時， 蒲公英中綠原酸未完全浸出， 當提取時間大于1.5 h 時綠原酸含量有所減小可能是因為超聲時間較長導致綠原酸結構發生變化或者是其他活性物質如黃酮、 色素等浸出量增大，造成綠原酸提取率略有減小。綜上所述，此次試驗控制了其他因素的影響，極大增強了試驗結果的可信度， 初步選擇超聲提取時間水平為1.5 h。

圖3 提取時間對綠原酸得率的影響

2.2.3 提取溶劑體積分數對蒲公英綠原酸得率的影響 由圖4 可知， 隨著提取溶劑體積分數的增加， 蒲公英中綠原酸的提取率會呈現先增加后減小的趨勢。 可以直觀看出當乙醇的體積分數達到50%時，蒲公英中綠原酸的提取率達到峰值。而出現提取率先增大后減小的趨勢可能是提取溶劑體積分數過大時蒲公英中一些脂溶性物質會被乙醇溶液大量浸出， 相當于給蒲公英中的綠原酸添加了一部分雜質，即會影響綠原酸的測定。另一方面可能是因為當乙醇的體積分數過大導致綠原酸中某些有效成分的變性失活， 破壞了綠原酸的原本結構，降低了從蒲公英中提取綠原酸的提取率。提取溶劑體積分數大成本高且不利于后期處理，綜上所述，初步選擇提取溶劑為體積分數為50%的乙醇水溶液。

圖4 提取溶劑體積分數對綠原酸得率的影響

2.2.4 提取溫度對蒲公英綠原酸得率的影響 由圖5 可知，隨著提取溫度的增加，蒲公英中綠原酸的提取率會呈現先增加后減小的趨勢。 可以直觀看出當提取溫度為60 ℃時，蒲公英中綠原酸的提取率達到峰值。 而出現提取率先增大后減小的趨勢可能是在一定范圍內升高溫度有助于提升分子擴散速率，從而增大提取率，但是當溫度過高時可能會增加其他雜質的浸出率或者導致綠原酸變性。 綜上所述，在保證提取率的前提下，初步選擇提取溫度為60 ℃。

圖5 提取溫度對綠原酸得率的影響

2.3 正交試驗結果 根據控制單因素變量可知，主要影響蒲公英中綠原酸提取率的因素有料液比（A），超聲振蕩溫度（B），乙醇的體積分數（C），超聲振蕩時間（D），選擇這四個影響因素的四個最佳水平，采用L16（45）正交表設計試驗，以蒲公英中綠原酸提取率為指標進行考察。 正交試驗結果的極差分析如表2 所示， 正交試驗結果的方差分析如表3 所示。由表2 可以看出，蒲公英中綠原酸提取的最佳工藝條件為A1B3C2D4，即料液比為1:12（g/mL），提取溫度為60 ℃，提取時間為1.5 h，提取溶劑體積分數為50%。 按此條件進行3 次驗證試驗， 取平均值， 得到蒲公英中綠原酸得率為3.18%。 由表3 可知，四個提取因素中，料液比、提取溫度、體積分數對綠原酸的提取影響均不顯著，而提取時間對綠原酸的提取影響非常顯著。因此，實際生產過程中可適當減少料液比， 降低提取溫度，減小體積分數，以降低生產成本。 但要嚴格控制提取時間，以保證較高的綠原酸提取率。

表2 正交試驗結果極差分析

表3 正交試驗方差分析表

2.4 綠原酸體外抗氧化性研究結果

2.4.1 綠原酸提取液對DPPH 自由基的清除能力由圖6 可知， 綠原酸提取液和VC 對于DPPH 自由基的消除能力趨勢是隨著濃度的增加而不斷增加的。 當濃度達到0.6 μg/mL 時，綠原酸提取液對DPPH 自由基消除能力達到最大值，為80%。綠原酸提取液和VC 對DPPH 自由基均有良好的清除能力，表明綠原酸具有良好的抗氧化能力，相同濃度下對于DPPH 自由基的清除能力略低于VC。

圖6 綠原酸提取液和VC 對DPPH 自由基的清除作用

2.4.2 綠原酸提取液對于羥基自由基的清除能力由圖7 可知， 綠原酸提取液對于羥基自由基具有很強的清除能力， 且隨著樣品濃度增加其對羥基自由基清除作用加強，當濃度達到0.6 μg/mL 時，綠原酸提取液對雙氧水中羥基自由基消除能力達到最大值，為79%。 在相同濃度下，綠原酸提取液對羥基自由基清除能力均高于VC 溶液， 說明綠原酸抗氧化活性高于VC 溶液。

圖7 綠原酸提取液和VC 對羥基自由基的清除作用

2.5 穩定性研究結果

2.5.1 金屬鹽離子對于綠原酸穩定性的影響 由圖8 可知，Zn2+、Na+對于綠原酸提取液中綠原酸影響不顯著，Fe2+和Fe3+會有一定的促進作用， 促進綠原酸提取液中綠原酸的含量增長； 可能是因為鐵離子與蒲公英綠原酸提取液中的一些雜質離子發生反應， 所以顯示綠原酸提取液中添加鐵離子之后對于綠原酸的含量增加有著促進作用。 而Cu2+對于綠原酸的含量有很大的抑制作用， 可能是因為銅離子更容易與蒲公英綠原酸提取液中的綠原酸發生反應， 導致蒲公英綠原酸提取液中綠原酸濃度的降低， 故蒲公英綠原酸提取液的保存應該要避免使用銅制品保存， 更不應該與銅制品接觸，防止綠原酸含量減少導致的活性低下，生理活性不強等問題。

圖8 金屬離子對綠原酸提取液穩定性影響

2.5.2 pH 對于綠原酸穩定性的影響 由圖9 可知，綠原酸在偏酸性環境中穩定性比較強，但是酸性強度太大也會導致綠原酸含量降低， 可能是綠原酸結構被破壞導致含量降低。 而且綠原酸不適合在pH 大于7 的堿性溶液中反應， 保存在堿性環境中會導致原有的綠原酸含量減小，可能是pH過大導致蒲公英提取液中綠原酸某些化學鍵的斷裂重組。 綜上所述與pH=7 的中性溶液相比，偏酸性環境比較適合綠原酸的存放， 堿性環境并不適合綠原酸參與的反應， 故綠原酸參與的反應最好在pH＝7 或偏酸性的條件下， 防止綠原酸的效能降低或者提取率降低。

圖9 pH 對綠原酸提取液穩定性影響

2.5.3 食品添加劑對于綠原酸穩定性的影響 由圖10 可知，山梨糖醇，焦亞硫酸鈉，葡萄糖等食品添加劑對于綠原酸提取液中綠原酸的含量有很大的抑制作用， 綠原酸已確定可以作為保健食品與飼料添加劑， 目前我國已經開始利用蒲公英中的綠原酸作為主要原材料制作一些飼料添加劑，故飼料添加劑中應注意綠原酸與其他一些食品添加劑的活性克制， 這三種食品添加劑經過試驗研究都會對蒲公英中提取出來的綠原酸含量產生一定抑制作用。綜上所述，在生產綠原酸有關飼料添加劑時要盡量避免與抑制綠原酸含量的其他添加劑一同制備。

圖10 食品添加劑對綠原酸穩定性影響

3 結論

本文采用超聲波輔助醇水溶液提取蒲公英中的綠原酸，在單因素試驗基礎上，以正交試驗優化了提取工藝， 得到蒲公英中綠原酸的最佳提取工藝條件為料液比1:12（g/mL），提取溫度60 ℃，提取時間1.5 h，提取溶劑體積分數50%，蒲公英中綠原酸平均得率3.18%。抗氧化性試驗結果表明，蒲公英中綠原酸具有較好的抗氧化性作用。 穩定性試驗結果表明， 蒲公英中綠原酸保存條件應在偏酸性且不宜與銅制品接觸。 此研究為將蒲公英中綠原酸進一步開發為天然低毒的功能性飼料提供理論參考。