大熊貓主食竹竹葉提取物對冷應激小鼠免疫功能的作用效應研究

陳建秋,方婷婷,彭 西,王 樂,唐春芳,袁施彬

(1.西華師范大學 生命科學學院,四川 南充 637009;2.成都大學 藥學院,成都 610106)

冷應激是指當外界環境溫度低于動物的最適生存溫度時,動物機體為了維持內環境的穩態,所作出的非特異性應答反應的總和[1]。當動物遭受冷應激時,會出現一系列諸如激素水平、能量代謝和免疫水平變化等應激反應。野生大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)的生活環境溫度在-10～25 ℃[2],且習慣生活在10 ℃左右的環境中[3]。研究發現,陜西佛坪國家級自然保護區的大熊貓從當年9 月到次年4 月,幾乎都在巴山木竹(Bashaniafargesii)林中(冬居地)活動,巴山木竹葉在其食物組成中的比例高達98.3%[4]。而該地區冬季平均溫度為-3 ℃[5],最低可降至-12.9 ℃。由此推測,該地區大熊貓冬季可能遭受著環境的冷應激。

植物提取物富含黃酮類、生物堿、多糖、皂苷、多酚和揮發油類等活性成分,具有抗氧化、抗菌、增強免疫力和改善動物腸道健康等生物學功能[6]。大量研究發現,許多植物提取物都具有一定的抗冷應激作用[7]。對于以竹為生的大熊貓,竹類既是食物,也是藥物。本課題組前期研究發現,陜西佛坪大熊貓可食竹中含具特殊藥效的植物次生代謝產物(Plant Secondary Metabolites,PSMs),其中黃酮類化合物具有提高動物免疫功能的作用[8],在大熊貓活動區域和它對竹的喜食部位中含量更為豐富[9]。栗明月等[10]研究發現,不同濃度的竹葉提取物(Bamboo Leaf Extract,BLE)能顯著提升常溫狀態下奶牛血液淋巴細胞(Lymphocytes,Lymph)數量、粒細胞(Granulocytes,Gran)數量和免疫球蛋白含量。同時,飼糧添加1.3 g·kg-1的BLE能顯著提高熱應激奶牛的免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)含量[11],改善了機體免疫功能。但大熊貓攝食竹中的PSMs是否具有提高冷應激條件下動物的免疫功能,抵抗內源性和外源性疾病因子的侵襲,目前尚無相關報道。因此,本研究以小鼠為研究對象,通過給慢性冷應激小鼠灌胃巴山木竹BLE,探究BLE對冷應激小鼠免疫功能的作用效應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和實驗設計

選取體重為20 g±2 g的7周齡雌性SPF級昆明小鼠240只(重慶騰鑫生物技術有限公司提供),按照2×2因子實驗設計分為常溫對照組、常溫BLE組、低溫對照組和低溫BLE組,每組5 個重復,每個重復12 只鼠。預飼1周。實驗期間,各處理組小鼠于每日早上08∶00進行稱重和灌胃,BLE組小鼠每天灌胃每克體重0.34 mg的BLE,對照組小鼠灌胃每克體重0.34 mg的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。小鼠均飼養于25 ℃環境中,低溫處理組小鼠每天于09∶00—13∶00移至4 ℃環境中處理4 h,實驗持續28 d,所有小鼠實驗期間自由采食與飲水。在實驗第14 d和第28 d,分別從每組中隨機選擇30只(共120只)小鼠進行采血和取樣。巴山木竹BLE的制備和BLE混懸液的配制具體方法參照文獻[9],BLE灌胃劑量參考課題組前期研究結果[12]。

1.1.2 主要儀器與試劑

儀器:CX22光學顯微鏡(日本OLMPUS公司);DM1000徠卡顯微成像系統(德國Leica公司);RM2235石蠟切片機(德國Leica公司);KD-98-Ⅱ A恒溫水浴鍋(中國天津市泰斯特儀器有限公司);HC-BC-2800Vet血細胞分析儀(中國Mindray公司);Epoch酶標儀(中國廣州儀器科學儀器有限公司);CytoFLEX流式細胞儀(美國Backman Coulter公司)。

試劑:蘇木素(美國Thermo Fisher公司);伊紅(美國Thermo Fisher公司);ELISA試劑盒(中國聯科生物);乙酸乙酯、多聚甲醛、無水乙醇和二甲苯等(中國成都市科隆化學品有限公司);Rat Anti-Mouse CD19-APC、Hamster Anti-Mouse CD3ε-FITC、Rat Anti-Mouse CD4-PE/CY5.5和Rat Anti-Mouse CD8α-PE/CY7(美國Southern Biothech公司)。

1.2 方法

1.2.1 脾臟組織病理學觀察

摘眼球法處死小鼠,取脾臟,用4 %多聚甲醛固定,固定時間大于24 h,按照常規切片制作方法進行脾臟組織樣品的脫水、切片、HE染色后顯微鏡下觀察脾臟組織病理學變化,并拍照記錄病變部位組織損傷。

1.2.2 血常規指標檢測

配制EDTA-K2抗凝劑,摘眼球取血液于對應抗凝管中,用HC-BC-2800Vet血細胞分析儀檢測血液Lymph、單核細胞(Monocytes,Mon)和Gran含量。

1.2.3 血清免疫蛋白含量檢測

摘眼球法取血,室溫靜置30 min,4 000 r·min-1離心10 min,制備血清。采用ELISA試劑盒檢測血清IgA、免疫球蛋白IgG(Immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)含量。

1.2.4 小鼠外周血T淋巴細胞亞群含量檢測

取100 μL外周血,分別加入Rat Anti-Mouse CD19-APC、Hamster Anti-Mouse CD3ε-FITC、Rat Anti-Mouse CD4-PE/CY5.5和Rat Anti-Mouse CD8α-PE/CY7流式抗體1 μg,混勻后4 ℃避光染色30 min。加入1 mL 1 X紅細胞裂解液,室溫孵育10 min,加入1 mL 4 ℃ PBS液混勻,250 g離心5 min,棄上清后加入2 mL PBS液洗滌1次,再加入400 μL PBS液,混勻后用CytoFLEX流式細胞儀檢測,采用Kaluza 2.1軟件對數據進行分析。

1.2.5 小鼠脾臟細胞凋亡率檢測

機械法剪碎脾臟組織,過濾,250g離心5 min,用PBS調節細胞濃度為106個·mL-1,取100 μL細胞懸液,250g離心5 min,棄去上清液后加入200 μL現配1 X結合緩沖液重懸細胞。先加入Annexin V-FITC染色熒光染料5 μL,室溫避光處理10 min;再加入PI染色劑10 μL,室溫避光染色5 min;最后加入結合緩沖液400 μL,混勻后用CytoFLEX流式細胞儀檢測,采用Kaluza 2.1軟件對數據進行分析。細胞凋亡率=凋亡細胞總數/細胞總數×100%。

1.2.6 小鼠脾臟T淋巴細胞亞群含量檢測

機械法剪碎脾臟組織,過濾,250g離心5 min,用PBS調節細胞濃度為106個·mL-1,取100 μL細胞懸液,分別加入Hamster Anti-Mouse CD3ε-FITC、Rat Anti-Mouse CD4-PE/CY5.5和Rat Anti-Mouse CD8α-PE/CY7流式抗體1 μg,混勻后4 ℃避光染色30 min。加入2 mL的PBS液洗滌1次,加入400 μL的PBS液重懸細胞后用CytoFLEX流式細胞儀檢測,采用Kaluza 2.1軟件對數據進行分析。

1.3 數據處理與分析

所有數據使用Excel 2016進行整理,并用SPSS 22.0進行數據統計分析,結果以平均數±標準誤表示,數據若符合正態分布,采用獨立樣本T檢驗分析組間差異,反之,采用Kruskal-Wallis檢驗。P<0.05表示差異顯著,P< 0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 脾臟病理組織學觀察

實驗第14 d,常溫對照組和常溫BLE組小鼠脾臟組織結構正常,未見明顯病理學改變(圖1a、b),低溫對照組和低溫BLE組脾竇擴張輕度淤血,脾小體內細胞空洞增多,空腔增大,空洞內核碎片較多(圖1c—f)。實驗第28 d,常溫對照組、常溫BLE組、低溫BLE組小鼠脾臟均未見明顯的病理學改變(圖2a、b、d),低溫對照組脾小體內細胞見較多空洞,空洞內核碎片較多(圖2c)。

2.2 血常規指標檢測結果

灌胃BLE對冷應激小鼠Gran、Mon和Lymph的影響見圖3。低溫和灌胃均對小鼠Gran、Mon和Lymph含量無顯著影響(P>0.05)。在實驗第14 d,與低溫對照組相比,低溫BLE組Gran(圖3a)、Mon(圖3b)和Lymph(圖3c)分別提升5.3 %、13.7 %和12.8 %;在實驗第28 d,與低溫對照組相比,低溫BLE組Gran(圖3a)、Mon(圖3b)和Lymph(圖3c)分別提升8.7%、22.0%和6.2%。

2.3 血清免疫球蛋白含量檢測結果

灌胃BLE對冷應激小鼠血清IgA、IgG和IgM的影響見圖4。在實驗第14 d,與常溫對照組相比,常溫BLE組和低溫對照組IgG(圖4b)含量均極顯著升高(P<0.01),低溫對照組IgM(圖4c)含量顯著升高(P<0.05);與低溫對照組相比,低溫BLE組IgG(圖4b)和IgM(圖4c)含量均極顯著降低(P<0.01);在實驗第28 d,與常溫對照組相比,常溫BLE組IgA顯著降低(P<0.05,圖4a),低溫對照組IgA含量極顯著降低(P<0.01,圖4a);與低溫對照組相比,低溫BLE組IgA含量極顯著降低(P<0.01,圖4a);與實驗第14 d相比,在實驗的第28 d,低溫對照組IgG含量極顯著降低(P<0.01,圖4b),低溫對照組IgM含量顯著降低(P<0.05,圖4c)。

2.4 外周血T淋巴細胞亞群檢測結果

灌胃BLE對冷應激小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和CD4+/CD8+的影響見圖5。在實驗第14 d,各處理組外周血CD3+(圖5a)、CD4+(圖5b)、CD8+(圖5c)和CD19+(圖5d)含量均無顯著差異(P>0.05)。在實驗第28 d,與常溫對照組相比,常溫BLE組CD19+含量極顯著升高(P<0.01,圖5d);與低溫對照組相比,低溫BLE組CD19+含量極顯著升高(P<0.01,圖5d)。與實驗第14 d相比,在實驗的第28 d,常溫BLE組CD8+極顯著降低(P<0.01,圖5c),而CD19+含量極顯著升高(P<0.01,圖5d);低溫BLE組CD19+含量和CD4+/CD8+值均極顯著升高(P<0.01,圖5d和5e)。

2.5 脾臟細胞凋亡率檢測結果

不同處理對小鼠脾臟細胞凋亡率的影響見圖6。在實驗的第14 d,與常溫對照組相比,常溫BLE組脾臟細胞凋亡率極顯著降低(P<0.01);與低溫對照組相比,低溫BLE組凋亡率極顯著降低(P<0.01)。與實驗第14 d相比,在實驗第28 d,常溫對照組凋亡率顯著降低(P<0.05);低溫對照組凋亡率極顯著降低(P<0.01)。

2.6 脾臟T淋巴細胞亞群檢測結果

不同處理對小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+的影響見圖7。在實驗的第14 d,與常溫對照組相比,低溫對照組CD4+含量極顯著降低(P<0.01,圖7b);與常溫BLE組相比,低溫BLE組CD4+極顯著降低(P<0.01,圖7b)。在實驗的第28 d,與常溫對照組相比,低溫對照組CD4+含量極顯著降低(P<0.01,圖7b),常溫BLE組CD8+含量顯著降低(P<0.05,圖7c);與常溫BLE組相比,低溫BLE組CD4+含量顯著降低(P<0.05,圖7b),低溫BLE組CD4+/CD8+含量顯著降低(P<0.05,圖7d)。

3 討 論

動物在受到冷應激時,機體在神經系統、內分泌系統和免疫系統的協同作用下,發生免疫調節。急性冷應激能夠提高小鼠的免疫能力,而慢性冷應激通常會抑制機體的免疫系統[13]。在參與機體免疫應答反應的相關免疫細胞中,淋巴細胞是特異性免疫反應的核心,中性粒細胞是通過吞噬作用清除入侵病原體的第一道防線,單核細胞則是激活淋巴細胞發揮特異性免疫作用的重要組成部分[14]。本研究發現,冷應激小鼠血液中Gran、Mon和Lymph含量不同程度的降低,表明持續的冷應激會抑制小鼠免疫反應。 眾所周知,植物提取物作為功能性添加劑已廣泛應用于食品和畜禽生產中。竹葉提取物富含黃酮類化合物、生物活性多糖、酚酸類化合物、蒽醌類化合物、萜類內酯、特種氨基酸和活性肽以及錳、鋅、硒等微量元素等,可通過食源進入動物機體發揮免疫調節作用進而提高動物機體的免疫功能[15]。本研究發現,低溫條件下灌胃BLE 14 d和28 d的小鼠血液Gran、Mon和Lymph含量變化無顯著性差異,可能的原因是小鼠免疫能力個體差異大,所以未達到顯著效果。但Mon含量較冷應激組分別提高了13.7 %和22.0 %,說明BLE能在一定程度上提高冷應激小鼠的特異性免疫反應。

免疫球蛋白是介導機體體液免疫反應的B細胞分泌產物,可以反映機體的免疫狀態[16]。Olfati等[17]研究發現,肉雞持續飼養在12 ℃的寒冷環境20 d后,血清中IgM和IgG含量顯著降低。本研究發現,冷應激處理顯著降低血清IgA含量,隨著冷應激的時間延長,血清IgM和IgG含量也下降。植物提取物對機體免疫反應的影響主要表現為血液中IgA、IgG和IgM含量的改變[18]。Fan等[19]研究發現,植物提取物能顯著提高母雞血液IgA和IgG含量。本研究發現,常溫下灌胃BLE第14 d時小鼠血清IgA和IgG含量均有所提升,說明BLE能在一定程度上調節小鼠的體液免疫。此外,T淋巴細胞可以通過細胞接觸依賴機制間接參與免疫應答,介導細胞免疫。王英華等[20]研究發現,大豆異黃酮能提高蛋雞外周血CD3+、CD4+含量。本研究發現,冷應激處理下小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+含量均降低,灌胃BLE則能提高外周血CD4+和CD19+含量,說明BLE能提高冷應激小鼠的細胞免疫。

脾臟作為動物體內最大的淋巴器官,是機體細胞免疫和體液免疫的中心,也是各種免疫細胞居住、增殖和產生免疫反應及免疫效應物質的基地[21]。持續的冷應激會使小鼠的脾臟組織發生漸進性退化現象[22]。前人研究發現,竹葉提取物可增加脾臟的重量,增強免疫細胞的活性[23]。在本研究中,冷應激小鼠脾臟出現明顯組織病理損傷,但灌胃BLE的冷應激小鼠的脾臟結構沒有明顯的病理變化,表明BLE能夠改善冷應激小鼠脾臟組織損傷。脾臟形態結構異常往往是其功能受損的重要外在體現。本研究發現,冷應激處理小鼠脾臟CD3+、CD4+和CD8+含量均降低,灌胃BLE則能提升脾臟CD3+、CD4+含量以及CD4+/CD8+值,表明低溫環境可通過降低小鼠脾臟T淋巴細胞總量進而降低小鼠細胞免疫功能,而BLE能從一定程度上緩解低溫環境對小鼠免疫功能的損傷。高溫或寒冷等多種外界刺激因子均會造成機體免疫抑制進而導致細胞凋亡[24]。細胞凋亡指機體為維持內環境穩定,在多種基因控制下,宿主細胞的程序性死亡,可以受到外源物質的影響而發生改變[25]。祖桂芳等[26]研究發現,BLE能降低細胞凋亡率且效果優于紅豆越橘提取物。在本研究中,冷應激處理小鼠脾臟細胞凋亡率顯著升高,灌胃BLE則能顯著降低小鼠脾臟細胞凋亡率,這說明BLE能夠減輕低溫刺激給小鼠脾臟帶來的細胞凋亡。綜上所述,BLE可通過促進冷應激下小鼠免疫細胞的增殖與分化,降低免疫器官的免疫損傷,來提高小鼠機體的細胞免疫和體液免疫,進而提高小鼠的免疫功能。

4 結 語

對特有的保護動物而言,全面了解其主要食物的營養生物學功能有助于確定影響其種群發展的主要因素,優化種群管理策略,實現種群的可持續性發展。本研究發現,大熊貓主食竹巴山木竹BLE可在一定程度上通過提高動物的細胞免疫、體液免疫和降低脾臟細胞凋亡率等來調節動物的免疫功能,抵抗低溫環境對動物造成機體重要的免疫器官(如脾臟等)的應激損傷。大熊貓以竹為生,保護區野生大熊貓在冬季尤以竹葉為主食。竹類不僅要滿足其生長、發育和繁殖等對營養的需求,還要滿足其抵抗內源性和外源性疾病因子侵襲的需求。結合相關探索性研究結果,進一步研究大熊貓主食竹中抗病化合物成分及其體內外作用機制,可深度解析野外大熊貓的精細覓食策略,在一定程度上提高就地保護和遷地保護成效。