豆粕飼料中添加丁酸鈉對大口黑鱸腸道菌群組成的影響

常 闊， 高世陽， 田二杰， 孫曉輝， 趙曉雨， 孫 平 ， 陳衛(wèi)軍

（1.河南科技大學(xué)，河南 洛陽 471000；2.洛陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，河南 洛陽 471023）

魚粉因富含蛋白質(zhì)、氨基酸組成平衡、適口性好等原因， 一直以來是肉食性魚類飼料中不可或缺的一種飼料原料（Hodar 等，2020）。 然而，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展以及魚粉的資源量有限（Jannathulla 等，2019），導(dǎo)致魚粉供不應(yīng)求，價格飆升，養(yǎng)殖的成本也隨之提高。為了解決魚粉短缺和其價格高昂的問題， 許多植物性原料被用于替代魚粉。豆粕是大豆提取油脂后的副產(chǎn)物，因蛋白質(zhì)含量高、來源廣泛、價格低廉，被認(rèn)為是最有希望替代魚粉的植物性蛋白源（Robinson 等，1994）。豆粕替代魚粉降低了養(yǎng)殖成本， 在一定程度上緩解了魚粉短缺的壓力，然而，其在水產(chǎn)飼料中的添加也造成了一些問題， 如改變魚類腸道內(nèi)微生物的菌群組成與結(jié)構(gòu)，造成腸道菌群失調(diào)（Zhou 等，2018；Miao 等，2018）。 腸道菌群通過自身或其代謝產(chǎn)物參與魚類的營養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)等過程，其穩(wěn)態(tài)對魚體生長和健康具有重要作用（Yukgehnaish 等，2020）。因此，在豆粕替代魚粉的過程中， 尋求改善魚類腸道菌群穩(wěn)態(tài)的營養(yǎng)策略已迫在眉睫。

丁酸鈉是丁酸的鈉鹽， 被廣泛用于畜禽和水產(chǎn)飼料， 具有促進魚體生長、 抗菌、 抗炎等功效（Abdel-Latif 等，2020）。 研究表明，丁酸鈉可用于改善水產(chǎn)動物的腸道菌群組成， 如羅非魚（Alves Jesus 等，2021）、大菱鲆（Liu 等，2019）和紅擬石首魚（Yamamoto 等，2021）等。大口黑鱸（Micropterus salmoides） 是一種具有較高的經(jīng)濟價值和深受消費者喜愛的淡水肉食性魚， 其對魚粉有著很強的依賴性， 飼料中魚粉的用量一般在40% ～ 55%（Yang 等，2022）。 已有研究結(jié)果表明， 豆粕替代30%魚粉會造成大口黑鱸腸道菌群紊亂 （He 等，2020）。為此，本研究以大口黑鱸為研究對象，擬在豆粕飼料中添加丁酸鈉， 研究丁酸鈉對其腸道菌群組成的影響， 以期為丁酸鈉在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 本試驗設(shè)置3 個處理組： 對照組、豆粕組、丁酸鈉組。 豆粕組替代對照組飼料中30%的魚粉； 丁酸鈉組是在豆粕飼料的基礎(chǔ)上添加0.2%的丁酸鈉。 飼料組成與營養(yǎng)水平見表1。各組原料均粉碎并通過60 目篩，逐級混合后，由環(huán)模顆粒機制成直徑為2.0 mm 的硬顆粒沉性飼料，室溫風(fēng)干并儲存在-20 ℃冰箱備用。

1.2 飼養(yǎng)管理 試驗用大口黑鱸魚苗購于廣東省某魚廠，為同一批繁殖的健康苗種。試驗于河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院開展。對魚體進行消毒后，于養(yǎng)殖間暫養(yǎng)7 d， 待其適應(yīng)環(huán)境后選取體質(zhì)量（6.30±0.01）g、 健康狀況良好的大口黑鱸180 尾，隨機分為3 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)20 尾。正式試驗在透明玻璃缸（60 cm×40 cm×50 cm）中進行，每日9：00 和17：00 投喂2 次，每次投喂至表觀飽食，養(yǎng)殖周期持續(xù)56 d。養(yǎng)殖期間水溫（25.5±0.6）℃，pH 為7.0 ～ 7.8， 溶氧量大于6 mg/L，氨氮和亞硝酸鹽濃度低于0.1 mg/L。

1.3 樣品采集與分析測定

1.3.1 樣品采集 投喂最后一餐后6 h， 每缸隨機取3 尾魚，使用三氯叔丁醇（5 g/L）安樂死。 隨后用消毒后的解剖剪剖腹，取出整個腸道。使用酒精棉擦拭腸管外壁后， 將全腸的內(nèi)容物收集在無菌凍存管中，液氮速凍，置于-80 ℃保存待測。

1.3.2 基因組DNA 提取和PCR 擴增 采用十六烷基三甲基溴化銨/十二烷基硫酸鈉法提取樣品總基因組DNA。提取的DNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 濃度和純度。 根據(jù)DNA 濃度用無菌水稀釋成1 ng/μL，用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。

以16S rRNA 的V3 和V4 區(qū)域為目標(biāo)合成帶有barcode 的特異引物。引物序列為338F（5′-ACT CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ′） 和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。 PCR 反應(yīng)在ABI GeneAmp9700 型上進行，反應(yīng)總體積為30 μL， 包含15 μL PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix、0.2 μmol 正反向引物和10 ng 模板DNA。 PCR 擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s， 共30個循環(huán)， 最后72 ℃延伸5 min。 將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Gene JET Gel Extraction Kit （Thermo Scientific）純化，QuantiFlourTM-ST （Promega 公司）定量。 使用NEB NextUltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina 試劑盒生成測序文庫， 并在Illumina MiSeq平臺上測序。

使用QIIME 軟件對序列數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析。使用97%相似度的分類單元（OUT），利用mothur 軟件做樣品稀釋性曲線。 采用基于β 多樣性距離的聚類分析和非度量多維尺度分析（NMDS） 描述不同樣本間的相似性和差異關(guān)系。采用STAMP 軟件比較不同處理腸道微生物在門和屬水平上的相對豐度。 利用PICRUSt 菌群代謝功能預(yù)測工具比對基因功能譜數(shù)據(jù)庫， 推測微生物群落的功能類別豐度信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。 使用SPSS v.20.0 軟件進行單因素方差分析； 利用Turkey-Kramer 事后檢驗進行組間差異比較。P＜0.05 表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序質(zhì)量分析 每個處理隨機抽取三個樣本， 使用稀釋性曲線檢測樣本測序數(shù)據(jù)量的合理性（圖1）。 當(dāng)測序數(shù)量大于4000 條時，不同處理組大口黑鱸腸道菌群稀釋性曲線趨于平緩。測序覆蓋率≥97%， 表明對各組的大口黑鱸腸道微生物菌群的測序深度合理， 能覆蓋樣品中的絕大部分物種。

圖1 樣品稀釋曲線

2.2 菌群結(jié)構(gòu)相似性分析 如圖2 所示，從大口黑鱸腸道內(nèi)容物中共鑒定獲得細菌21 個綱，88個目， 374 個屬，691 個OTU。 對照組特有綱、目、屬和OUT 的數(shù)量分別為1、9、62 和162； 豆粕組特有綱、 目、 屬和OTU 的數(shù)量分別為1、6、39 和92；丁酸鈉組特有綱、目、屬和OTU 的數(shù)量分別為2、6、58 和151。 對照組和豆粕組共享12 個綱、48個目、134 個屬和181 個OTU。對照組和丁酸鈉組共享15 個綱、55 個目、154 個屬和202 個OTU。

圖2 大口黑鱸腸道菌群Venn 圖

為了進一步比較不同處理組腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異， 采用基于菌群β 多樣性的聚類分析和NMDS 分析各處理組腸道菌群樣品。聚類分析中，對照組和豆粕組樣品間的距離較遠， 而對照組和丁酸鈉組樣品間的距離較短（圖3A）。與聚類樹結(jié)果類似，NMDS 分析中，對照組和丁酸鈉組樣品分布于坐標(biāo)軸的左側(cè)， 而豆粕組樣品分布于坐標(biāo)軸的右上側(cè)（圖3B）。

圖3 大口黑鱸腸道菌群相似性分析

2.3 菌群組成及其相對豐度分析 各處理組腸道所含的菌門主要為藍藻門 （Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、軟壁菌門（Tenericutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（圖4A）。 相比于對照組，豆粕組厚壁菌門、 擬桿菌門、 綠彎菌門（Chloroflexi）和糖化細菌門（Saccharibacteria）的相對豐度分別降低了89.4%、81.7%、87.7%和100.0%（P＜0.05）， 軟壁菌門的相對豐度升高了4797.0%（P＜0.05）。 相比于豆粕組，丁酸鈉組軟壁菌門和厚壁菌門的相對豐度分別降低和升高了98.3%和442.8%（P＜0.05）（圖4B）。

圖4 大口黑鱸腸道菌群在門水平上的相對豐度

大口黑鱸所含的菌屬主要為支原體屬（Mycoplasma）、虛構(gòu)芽孢桿菌屬（Fictibacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、 魏斯氏菌屬（Weissella）、Alpinimonas 屬、紅球菌屬（Rhodococcus）、束村氏菌屬（Tsukamurella）、戈登氏菌屬（Gordonia）、 糞桿菌屬 （Faecalibacterium） 和擬桿菌屬（Bacteroides）（圖5A）。 相比于對照組，豆粕組虛構(gòu)芽孢桿菌屬、 乳桿菌屬、 魏斯氏菌屬和片球菌屬（Pediococcus） 相對豐度分別降低了90.0%、95.6%、71.2%和73.9%（P＜0.05），支原體屬相對豐度增加了5073.0%（P＜0.05）。 相比于豆粕組， 丁酸鈉組支原體屬相對豐度降低了98.3%（P＜0.05）， 擬桿菌屬和葡萄球菌屬（Staphylococcus）相對豐度分別升高了911.1%和569.0%（P＜0.05）。

圖5 大口黑鱸腸道菌群在屬水平上的相對豐度

2.4 腸道菌群功能預(yù)測 利用PICRUSt 將不同處理組大口黑鱸腸道菌群的16S RNA 基因比對到EggNOG （Evolutionary Genealogy of Genes：Non-supervised Orthologous Group）數(shù)據(jù)庫，進行菌群功能預(yù)測。 COG 功能分類統(tǒng)計結(jié)果表明，相比對照組，豆粕組大口黑鱸腸道菌群在“氨基酸轉(zhuǎn)運代謝”“細胞運動”“RNA 加工修飾”“脂質(zhì)轉(zhuǎn)運代謝”“細胞骨架”“翻譯后修飾， 蛋白質(zhì)折疊和伴侶蛋白”“能量生成和轉(zhuǎn)換”“翻譯、 核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成” 等功能類群的相對豐富顯著升高，在“抵御機制”“碳水化合物轉(zhuǎn)運代謝”“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制”“復(fù)制、重組和修復(fù)”功能類群的相對豐富顯著降低（P＜0.05）。 相比于豆粕組，丁酸鈉組大口黑鱸腸道菌群在 “復(fù)制、 重組和修復(fù)”功能類群的相對豐度顯著升高，在“次級代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運和代謝”功能類群的相對豐度顯著降低（圖6）（P＜0.05）。

圖6 大口黑鱸腸道微生物COG 功能分析

3 討論

魚體腸道微生物菌群及其代謝產(chǎn)物與腸道功能密切相關(guān)，在宿主代謝、營養(yǎng)、生理和免疫過程中發(fā)揮著重要作用（Gerritsen 等，2011）。 本研究中，豆粕替代魚粉嚴(yán)重改變了腸道菌群組成，這與大口黑鱸（He 等，2020）和烏鱧（Miao 等，2018）的研究結(jié)果一致。 然而， 豆粕替代魚粉飼料中添加0.2%丁酸鈉，在一定程度上恢復(fù)了腸道菌群的組成。 菌群Venn 圖、聚類樹和NMDS 分析結(jié)果均表明， 丁酸鈉組和對照組魚體腸道菌群的組成更加接近，這表明丁酸鈉有助于腸道菌群的恢復(fù)。

厚壁菌門是魚類腸道菌群的主要門類， 可增強腸道屏障功能，減輕炎癥反應(yīng)，包括乳桿菌、虛構(gòu)芽孢桿菌、糞桿菌、魏斯氏菌片球菌和葡萄球菌等菌屬（Yukgehnaish 等，2020；Kaur 等，2019）。 乳桿菌、虛構(gòu)芽孢桿菌、魏斯氏菌、片球菌和葡萄球菌是重要的乳酸菌 （Ringo/等， 1998；Vandenbergh等，1993）；糞桿菌能夠產(chǎn)生丁酸（Macfarlane 等，2012）。 擬桿菌也可產(chǎn)生乳酸。 乳酸菌和丁酸與魚體腸道健康密切相關(guān)， 可增強魚體生長和免疫（Abdel-Latif 等，2020；Ringo 等，2010）。 本研究中， 豆粕替代魚粉顯著降低了厚壁菌門、 乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬的相對豐度。然而豆粕飼料中添加0.2%的丁酸鈉顯著增加了厚壁菌門、擬桿菌屬和萄球菌屬的相對豐度， 表明丁酸鈉可增加腸道有益菌含量，改善腸道健康。

支原體屬于軟壁菌門， 是已知最小的能夠自我復(fù)制的自由生活微生物之一（Sellyei 等，2021），也是導(dǎo)致腸道相關(guān)疾病（如腸炎）的潛在致病細菌（Gnanadurai 等，2020；Razin 等，1998）。 豆粕替代魚粉顯著提高了大口黑鱸腸道菌群中支原體的相對豐度， 這與大口黑鱸之前的研究結(jié)果一致（Yang 等，2022；He 等，2020）。 支原體相對豐度升高在魚類中已被證明與炎癥存在極顯著正相關(guān)（Chen 等，2023），可能是造成豆粕誘導(dǎo)性腸炎的主要因素。本研究中，相比對照組，豆粕飼料大口黑鱸在“抵御機制”功能類群的相對豐度顯著降低，這可能與豆粕飼料易引起腸炎和降低魚體疾病抵抗力等現(xiàn)象有關(guān) （Urán 等，2008；Krogdahl等，2000）。 本研究中，豆粕飼料添加丁酸鈉顯著降低了支原體相對豐度，表明丁酸鈉可能具有緩解豆粕誘導(dǎo)性腸炎的作用。丁酸鈉降低支原體相對豐度的現(xiàn)象也出現(xiàn)在其他水產(chǎn)動物中，如鯽魚（Li 等，2022） 和攝食高脂飼料的大口黑鱸（Chen等，2023）。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在豆粕日糧中添加0.2%的丁酸鈉可以有助于大口黑鱸腸道菌群恢復(fù)， 增加腸道有益菌含量，抑制腸道有害菌增殖，保護腸道健康。