軟顆粒飼料中替代魚粉對選育中間養(yǎng)成階段的凡納濱對蝦生長性能、體組成和免疫的影響

王 寧， 鄧 登， 馬迎飛， 鄧康裕

（1.深圳市澳華集團股份有限公司，廣東 深圳 518054；2.中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院，合成生物學(xué)工程研究中心，廣東 深圳 518055）

蝦類養(yǎng)殖是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，我國作為世界第一養(yǎng)蝦大國更是如此。 生產(chǎn)的迅猛發(fā)展使得優(yōu)質(zhì)種苗成為對蝦健康養(yǎng)殖發(fā)展的制約因素，而營養(yǎng)作為親蝦培育的關(guān)鍵因素之一，直接決定著親蝦的繁殖性能和種苗質(zhì)量 （Racotta 等，2003；Wouters 等，2001）。 由于親蝦培育階段的營養(yǎng)學(xué)和飼料學(xué)的研究嚴重滯后， 導(dǎo)致目前配合飼料在親蝦培育過程中使用率較低且多在親蝦培育前期的營養(yǎng)強化階段使用（王寧等，2022），而當前親蝦培育過程中主要使用的鮮活或冰凍天然餌料（沙蠶、魷魚、雙殼貝類等），因其價格昂貴、易引入病原和質(zhì)量不穩(wěn)定而嚴重制約對蝦種業(yè)的綠色高質(zhì)量發(fā)展（杜少波等，2002）。長期的生產(chǎn)與科研實踐都毫無辯駁的證明， 要實現(xiàn)對蝦種業(yè)的綠色高質(zhì)量發(fā)展，必須提高配合飼料替代天然餌料率（杜少波等，2002），因此，就必須解決配合飼料相比于天然餌料誘食性差及營養(yǎng)成分不足的問題。

軟顆粒飼料是指將新鮮或冷凍的生物餌料或漿狀原料同具有特定營養(yǎng)成分或功能的粉狀配合飼料按一定比例配在一起， 攪拌均勻后經(jīng)軟顆粒機擠壓成型， 可直接投喂或者冷凍后投喂（毛連環(huán)，2020；黃偉卿等，2018）。相比于硬顆粒飼料，軟顆粒飼料在制作過程中較大程度的保留了原料中的營養(yǎng)成分，特別是一些活性酶、維生素及未知因子。 研究表明，軟顆粒飼料具有適口性好、營養(yǎng)消化吸收好、水質(zhì)污染少等諸多優(yōu)點。 目前，在水產(chǎn)動物如牙鲆 （Paralichthysolivaceus）（林建斌等，2006）、點帶石斑魚（Epinephlus coioides）（林建斌等，2007）、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）（陳度煌等，2013）、羅非魚（Oreochromis mossambicus）（韓金林，2015；Peters，1852）等魚類以及三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）（何爾榮等，2007）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）（毛連環(huán)，2020）等甲殼動物上證實， 軟顆粒飼料具有提高生長速率和成活率、降低養(yǎng)殖成本和水質(zhì)污染的效果。

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）作為我國養(yǎng)殖對蝦的主要品種之一（Liao 等，2011），每年對凡納濱對蝦親蝦的需求量約150 萬對， 并且主要依賴于從國外高價進口， 國內(nèi)自主選育品種的市場占有率不高（冀德偉等，2021）。親蝦選育已成為制約我國對蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的“卡脖子”問題。 本試驗旨在探討軟顆粒飼料配方對親蝦培育階段的凡納濱對蝦生長性能、 體組成和血清非特異性免疫的影響， 以期為實現(xiàn)親蝦飼料精準設(shè)計和對蝦種業(yè)的綠色高質(zhì)量發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 試驗所用魚粉為超級紅魚粉，其原料為智利鐵甲魚。 酶解魚漿（FPH）其原料為鳀魚和野雜魚，酶解蝦漿（SPH）其原料為太平洋磷蝦， 二者均由益爾生物科技有限公司研制。 白鰱[Hypophthalmichthys molitrix（Valenciennes，1844），LY]購自深圳市南澳海鮮市場，取軀干部魚肉放入絞肉機絞碎后置于-80 ℃保存， 使用時置于4 ℃溶化后使用。 杜氏槍烏賊（Loligo duvaucelii，YY）（魷魚）購自深圳市南澳海鮮市場，去除內(nèi)臟后放入絞肉機絞碎后置于-80 ℃保存， 使用時置于4 ℃融化后使用。 原料的常規(guī)營養(yǎng)成分組成見表1。

表1 原料的常規(guī)營養(yǎng)成分

對照組（FM）飼料配方由深圳市澳華集團股份有限公司提供。 分別以FPH、SPH、LY 以及YY替代FM 組15%魚粉蛋白設(shè)計四個替代組。 以上共設(shè)計5 組等氮等脂飼料。 各組飼料氨基酸組成見表2。

表2 試驗飼料氨基酸組成（干物質(zhì)）%

將飼料原料進行超微粉碎后過80 目篩，按表1 配方將干料按梯度混勻法逐級擴大混勻后，之后依次加入溶有大豆卵磷脂的魚油、 鮮料或者水，人工充分混勻。將混勻后的飼料原料通過軟顆粒制粒機（EL-400 型，山東威海高科技產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)友誼機械廠）制成軟顆粒飼料，放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗過程與管理 凡納濱對蝦及養(yǎng)殖試驗由深圳市澳華集團股份有限公司提供和完成。 在試驗正式開始前，暫養(yǎng)2 周。試驗使用體格健壯無損傷、性腺未開始發(fā)育的（25.0±0.33）g 凡納濱對蝦親蝦300 尾，隨機分配于15 個養(yǎng)殖桶中（3 重復(fù)/處理，20 尾/重復(fù)）。 每天飽食投喂4 次（6：00、10：00、14：00 和18：00）至表觀飽食。養(yǎng)殖周期為8周。養(yǎng)殖系統(tǒng)為室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)。在養(yǎng)殖過程中，水溫保持在25 ～27 ℃， 鹽度為28‰～30‰， 溶氧≥6 mg/L，氨氮≤0.05 mg/L。 每日換水1 次。

1.3 樣品采集 養(yǎng)殖試驗正式結(jié)束時，對蝦饑餓24 h 后記錄每桶凡納濱對蝦的數(shù)量和重量。 每桶隨機抽取6 尾蝦置于-20 ℃冷藏用作全蝦體常規(guī)成分分析。 另每桶隨機抽取6 尾蝦，用1 mL 無菌注射器從蝦圍心腔內(nèi)取血液置于離心管中， 并放置于4 ℃環(huán)境中靜置24 h 后2500 r/min 離心10 min， 收集上層清液置于-80 ℃保存以備血淋巴免疫指標的檢測。

1.4 生化組成指標 試驗飼料和蝦體的生化分析方法參照程逍妹等（2018）的方法。 粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法（GB/T 6432-94）測定，粗脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T 6433-2006）測定，水分含量采用烘干法（GB/T 6435-2014）測定，灰分含量采用馬弗爐灼燒法（GB/T 6438-2007）測定，飼料的氨基酸組成采用鹽酸水解法（GB/T 18246-2019）測定。

1.5 非特異性免疫酶活力測定 血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶（LZM）活性的測定均采用南京建成生物公司的試劑盒，相應(yīng)操作均參照說明書進行。

1.6 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析 生長性能的相關(guān)計算公式如下：

試驗數(shù)據(jù)用 “平均值±標準誤” 表示。 采用SPSS 20.0 版軟件統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)。采用單因子方差分析（ANOVA）對試驗結(jié)果進行方差分析，采用Tukey’s 法進行多重比較。P＜0.05 表示差異性顯著。

2 試驗結(jié)果

2.1 生長性能 不同處理組對凡納濱對蝦生長性能的影響見表3。 研究表明，F(xiàn)PH 和SPH 替代15%魚粉蛋白后其增重率高于FM 組但二者之間的差異不顯著（P＞0.05）。 LY、YY 組增重率分別較FM組提高11.6%、15.3%（P＜0.05），并且YY 組的增重率比LY 組高3.7%但二者之間差異不顯著 （P＞0.05）。 LY 組增重率比FPH 和SPH 組分別高9.6%和7.6%，但同SPH 組之間差異不顯著（P＞0.05）。各組的成活率無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 不同處理對凡納濱對蝦生長和存活的影響

2.2 全蝦體組成 不同處理組對凡納濱對蝦全蝦體組成的影響見表4。 檢測凡納濱對蝦全蝦體成分的結(jié)果表明，各處理間凡納濱對蝦的水分、脂肪和灰分沒有顯著差異 （P＞0.05）。 SPH、LY 和YY 組的蛋白含量分別比FM 組高1.43%、1.58%和1.80%（P＜0.05）；SPH 組和FM 組的全蝦體蛋白質(zhì)含量沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表4 不同處理對凡納濱對蝦全蝦體組成的影響%

2.3 血清非特異性免疫酶活力 不同處理組對凡納濱對蝦血清非特異性免疫酶活力的影響見表5。 不同處理組對凡納濱對蝦血清中的AST 和ALT 的活力無顯著影響（P＞0.05）。 LY、YY 組的AKP 活力分別比FM 組提高20.5%和21.1%（P＜0.05）， 但同SPH 組和FPH 組相比無顯著性差異（P＞0.05）。FM 組ACP 活力要顯著低于其余各組（相比于FPH、SPH、LY 和YY 組，F(xiàn)M 組分別低8.3%、7.0%、15.2%和16.1%）（P＜0.05），此外，LY組和YY 組的ACP 活力要顯著高于SPH 組（LY組8.1%、YY 組10.4%） 和FPH 組 （LY 組7.4%、YY 組9.7%）（P＜0.05）。 FM 組和FPH 組的SOD活力要顯著低于LY 組 （FM 組20.0%、FPH 組12.6%）和YY 組（FM 組19.3%、FPH 組11.8%）（P＜0.05）， 但同SPH 組無顯著性差異（P＞0.05）。LY 組和YY 組LZM 的活力相比于FM 組分別提高16.0%和22.5%（P＜0.05），但同SPH 組和FPH組無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 不同處理對凡納濱對蝦血清非特異性免疫酶活力的影響

3 討論

研究表明，海產(chǎn)蛋白酶解物富含游離氨基酸、小肽、?；撬岬葼I養(yǎng)因子（吳代武，2018），在飼料中添加適量的海產(chǎn)蛋白酶解物能夠有效提高水產(chǎn)動物的生長率和攝食率 （Kousoulaki 等，2012；Berge 等，1996）。 在本試驗中，飼料中添加適宜的酶解魚漿和酶解蝦漿代替魚粉提高了南美白對蝦的終末體重。其中，SPH 組增重率要高于FPH 組，這可能是由于酶解蝦膏的原料磷蝦中富含蝦青素（劉志東等，2021），蝦青素被證實可以提高包括南美白對蝦在內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長速度（王海芳等，2016）。 魷魚作為南美白對蝦培育過程中一直使用的天然餌料， 在親蝦繁育過程中取得了較好的效果（杜少波等，2002）。 陳泳先等（2011b）在研究中發(fā)現(xiàn)，以鰱魚卵、鰱魚肉、水絲蚓、蚯蚓、水絲蚓+鰱魚卵、 配合親蝦飼料共計六種餌料飼喂南美白對蝦親蝦，投喂鰱魚肉組的綜合表現(xiàn)最好。在本試驗中，LY 組和YY 組均取得了較好的養(yǎng)殖效果。研究表明，飼料原料的新鮮度直接影響?zhàn)B殖動物的生長效果（葉元土，2006）。 在本試驗中，鰱魚肉和魷魚的揮發(fā)性鹽基氮值更低， 取材更為新鮮， 這可能是LY 組和YY 組均取得了較好的養(yǎng)殖效果的原因。此外，鰱魚肉和魷魚的氨基酸含量豐富， 且必需氨基酸模式同雞蛋蛋白氨基酸模式相近（邱月等，2016；韓素珍等，1999；金慶華等，1998）。同時，研究表明，鰱魚肉和魷魚均富含高不飽和脂肪酸（邱月等，2016；陳泳先等，2011b）。 這可能是導(dǎo)致LY 組和YY 組均取得了較好的養(yǎng)殖效果的原因。

飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)被水產(chǎn)動物消化吸收后用作自身生長和組織更新， 因此蝦體組織生化含量的變化在一定程度上反映了其對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況（李二超等，2009）。 海產(chǎn)蛋白酶解物替代魚粉對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體成分的影響在不同試驗條件下結(jié)果不一致。 Refstie 等（2004）對大西洋鮭（Salmo salar）的研究結(jié)果顯示，使用酶解魚蛋白替代飼料中15%的魚粉可顯著提高魚體的粗蛋白質(zhì)含量。 Aires Oliva-Tele 等（1999）對大菱鲆（Scophthalmus maximus）的研究表明， 使用酶解魚蛋白替代魚粉未對大菱鲆體組成中的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分產(chǎn)生顯著影響。 相似的結(jié)果也見于符策峰等（2021）在珍珠龍膽石斑魚 （Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）飼料中使用酶解蝦膏替代一定比例的魚粉和周露陽 （2019） 在黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）中使用酶解蝦膏和酶解魚膏替代一定比例的魚粉的研究中。 本試驗條件下， 飼料中添加一定比例的酶解魚漿和酶解蝦漿代替魚粉顯著提高了蝦體粗蛋白質(zhì)含量， 而對水分、 粗脂肪和灰分均未產(chǎn)生顯著影響，表明試驗對象、海產(chǎn)蛋白酶解物替代水平、飼料配方組成及工藝等的差異都會影響?zhàn)B殖動物體組成。 此外，在本試驗中使用鰱魚肉和魷魚替代一定比例的魚粉未對南美白對蝦體組成中的水分、粗脂肪和灰分造成顯著影響，但顯著提高了蝦體粗蛋白質(zhì)含量， 并且效果優(yōu)于酶解魚漿組和酶解蝦漿組。 這可能是由于鰱魚和魷魚更新鮮，組胺含量更低，而飼料中組胺含量升高能夠顯著降低養(yǎng)殖動物腸道蛋白酶活性 （馬德英等，2020）。

親蝦繁育過程應(yīng)激大、繁育時間長，因此親蝦的免疫水平和健康程度直接影響親蝦繁育的幼體質(zhì)量和數(shù)量（Racotta 等，2003）。 甲殼動物缺少特異性淋巴細胞，因而不具備特異性免疫，僅依賴于非特異性免疫機制來抵抗病原菌入侵（Somboonwiwat 等，2006；Young 等，2002）。其中，ACP、AKP、SOD 和LZM 活力是衡量甲殼動物免疫機能的重要指標 （程逍妹等，2018；Vallejos-Vidal等，2016； 黃旭雄等，2007；Giannini 等，2005；Rengpipat 等，2000）。此外，AST 和ALT 作為氨基酸代謝中的關(guān)鍵酶， 當肝胰臟等受到損傷時轉(zhuǎn)氨酶會釋放到血液中從而造成血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的升高， 因而常被用來表征甲殼動物及其他動物肝胰腺的損傷程度（Barcellos 等，2004）。 在本試驗中， 各替代組的AST 和ALT 活力指標同對照組相比無顯著性差異， 表明鮮料替代魚粉未對南美白對蝦肝胰腺產(chǎn)生損傷， 機體處于較為健康的狀態(tài)下，這與存活率的結(jié)果相一致。 這與許聰?shù)龋?022）在大菱鲆上的研究結(jié)果相似，在高魚粉組飼料中適宜的鮮料替代魚粉比例不會對大菱鲆的代謝造成損傷。 研究表明，海洋水解蛋白能夠有效保持魚蛋白水解物新鮮度和魚體特殊活性成分， 適宜比例的替代魚粉可以有效提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的非特異性免疫（Zheng等，2013）。 在本試驗中SPH 組和FPH 組替代魚粉后均顯著提高了南美白對蝦的非特異性免疫能力， 這與之前在水產(chǎn)動物上的研究結(jié)果相似（Khosravi 等，2015）。 研究表明，軟顆粒飼料可以提高甲殼類動物的存活率（毛連環(huán)，2020；黃偉卿等，2018）。 此外，軟顆粒飼料還被證明可以有效降低水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的病蟲害的感染率 （施學(xué)文，2013）。 在本研究中，使用LY 和YY 制作的軟顆粒飼料顯著提高了南美白對蝦的非特異性免疫， 這與軟顆粒飼料提高甲殼動物的存活率相對應(yīng)。

4 結(jié)論

以生長性能、 體組成和免疫指標作為判斷依據(jù)， 使用軟顆粒飼料投喂選育中間養(yǎng)成階段的凡納濱對蝦時，飼料中添加一定比例的酶解魚漿、酶解蝦漿、 鰱魚和魷魚來替代魚粉可以顯著提高飼料的投喂效果，其中以鰱魚和魷魚效果最佳。