不同苜蓿越冬期根系生理代謝響應研究

王曉龍， 楊 曌 ， 來永才， 鐘 鵬， 柴 華， 李莎莎，徐艷霞， 吳 玥， 王建麗， 高海娟， 李 莉， 張 楊， 李 偉

（1.黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；2.黑龍江省農業科學院博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150086；3.黑龍江省農業科學院草業研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）具有產量高、品質優、適應性強、適口性好等優良特性（趙一航等，2021；朱愛民等，2019）。但在我國北方地區種植，部分苜蓿品種存在越冬率偏低的問題，并且苜蓿品種不同表現出來的越冬率亦不同。黑龍江地區是我國重要的畜牧業發展基地， 特別是奶牛、肉牛等養殖業的發展帶動了苜蓿產業的全面發展。然而影響黑龍江地區苜蓿生長最為關鍵的因素之一是越冬。正因如此選擇適宜黑龍江地區種植的苜蓿品種，不僅要求高產、優質，而且還應具有較強的抗寒性（崔國文，2009）。 寒冷地區苜蓿引種或管理不當會導致苜蓿越冬率偏低，甚至苜蓿植株大量死亡，給種植戶和企業造成巨大的經濟損失。目前解決苜蓿越冬問題的關鍵是了解苜蓿對寒冷適應的規律和特點，以及苜蓿根系對抗寒性的響應（王曉龍等，2022；馬周文等，2016；Brumme 等，2002）。當植物面臨低溫時，體內會產生一系列生理生化反應，通過提高一些調節物質如游離脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）、超氧化物歧化酶（SOD）等含量和酶活性來保護植物免受低溫傷害，這些調節物質常被作為評價植物抗寒性的重要指標（馬周文等，2016）。 通常苜蓿在秋末冬初停止生長， 地上部的營養物質會轉移至根部，以備翌年再生。 所以苜蓿根系既是植物生長時水分和營養物質的吸收器官，亦是苜蓿越冬時重要的貯藏器官，其存儲營養物質的多少直接影響著植株的越冬與再生性。由于耐寒性是一個復雜的數量性狀，僅靠單一指標還無法判定苜蓿的抗低溫能力強弱，因此，如何選擇適宜的生理指標來評價苜蓿品種抗寒性，已成為當前寒區苜蓿產業化發展亟須解決的一大難題（李波等，2021；Cunningham 等，2001）。所以本研究以國內外不同苜蓿品種為試驗材料， 通過對苜蓿越冬期根系內的滲透調節物質、 細胞膜脂質過氧化和保護酶活性等物質進行測定， 旨在探究苜蓿越冬期根系生理代謝響應機制， 并評價出不同品種之間的抗寒性強弱等級， 為寒區苜蓿引種栽培及抗寒種質資源鑒定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況 試驗地位于齊齊哈爾市富拉爾基，E 123°24′36″，N 47°9′，最低溫度-39.5 ℃，年均氣溫3 ℃，積溫（≥10 ℃）2722.1 ℃，年均降水量約480 mm，無霜期132 d 左右。 試驗地土壤為黑風沙土，有機質19.89 g/kg，全氮1.19 g/kg，速效磷10.60 mg/kg，速效鉀124.84 mg/kg。

1.2 試驗材料 選取國內外苜蓿材料5 份，其中草原3 號由內蒙古農業大學提供； 公農2 號由中國農業科學院草原所提供； 龍牧801 由黑龍江省農業科學院提供；皇后、賽迪苜蓿由百綠（天津）國際草業有限公司提供。

1.3 試驗設計 試驗小區面積20 m2（4 m×5 m），2021 年6 月進行人工條播，采用隨機區組設計，行距40 cm，3 次重復，以龍牧801 為保護行。 播前試驗小區均未施底肥，播種后及時鎮壓。 試驗期間進行灌溉、 除草、 病蟲防治等田間管理措施。 越冬期每隔60d（冷脅迫：10 月30 日；凍脅迫：12 月30 日）田間挖取苜蓿根系，以8 月30日為對照（CK），測定供試品種越冬期根系各項生理指標。

1.4 測定方法 生理指標測定參照史樹德等（2011）主編的《植物生理學實驗指導》方法進行。游離脯氨酸（Pro）測定采用茚三酮法；可溶性糖（SS）測定采用蒽酮法；可溶性蛋白（SP）測定采用考馬斯亮藍法；丙二醛（MDA）測定采用硫代巴比妥酸法；SOD 測定采用氮藍四唑法； 相對電導率（EC）測定采用電導法。

1.5 統計分析 采用Excel 2010 軟件進行數據處理， 用Sigma Plot 12.5 軟件作圖，SAS 9.0 軟件進行方差分析和相關性分析。 應用模糊數學隸屬函數法（王曉龍等，2022；趙一航等，2021），綜合評價所測指標，求各項生理指標隸屬函數值，若測定指標與苜蓿低溫抗寒性呈正相關：

測定指標與苜蓿低溫抗寒性呈負相關：

式中：Fij為i 草種j 指標值；Xij為鑒定i 草種j 指標隸屬值；Ximax為所鑒定i 草種j 指標最大值；Ximin為所鑒定i 草種j 指標最小值。 將i 草種各項指標函數值進行累加，求平均值，均值越大則苜蓿品種耐寒性越強。 最后將5 個苜蓿品種的耐寒性進行比較，得出品種間抗寒強弱順序。

2 結果與分析

2.1 可溶性糖和游離脯氨酸 由圖1 可知，供試品種根系中可溶性糖和游離脯氨酸含量均呈先升后降的變化，可溶性糖含量由38.13 ～39.62 mg/g升至51.86 ～60.27 mg/g 又降至43.19 ～52.95 mg/g； 游離脯氨酸含量由364.88 ～374.44 nmol/g升至630.86 ～689.53 nmol/g 又降至463.60 ～628.21 nmol/g；冷脅迫下，各品種可溶性糖積累量呈現最高值，以品種龍牧801、草原3 號和公農2 號的可溶性糖含量較高， 其次是皇后苜蓿（57.21 mg/g）， 而賽迪苜蓿可溶性糖含量顯著低于其他品種（P＜0.05）。 隨脅迫程度加劇，各品種可溶性糖含量有所下降， 其中龍牧801 和公農2號的可溶性糖含量顯著高于其他品種（P＜0.05），而皇后和賽迪苜蓿較低。

圖1 苜蓿根系可溶性糖和游離脯氨酸含量變化

冷脅迫下， 各品種游離脯氨酸含量亦呈現最高值，與對照組相比增高72.36% ～84.15%，且各品種間差異較大， 其中龍牧801 和公農2 號游離脯氨酸含量顯著高于其他品種（P＜0.05），草原3號次之， 而皇后和賽迪苜蓿游離脯氨酸積累量較低；凍脅迫下，龍牧801 的游離脯氨酸含量最高，相比游離脯氨酸最低賽迪高35.51%，且顯著高于其他品種（P＜0.05）。上述結果表明，越冬初期，耐寒品種通過積累較多的可溶性糖和游離脯氨酸含量來抵御嚴冬， 反之抗寒性弱的品種可溶性糖和游離脯氨酸含量較低。

2.2 可溶性蛋白和SOD 由圖2 可知， 所有品種根系可溶性蛋白含量由37.96 ～38.58 μg/g 升至45.05 ～53.10 μg/g 又降至40.21 ～41.96 μg/g。冷脅迫下，各品種可溶性蛋白含量迅速增加，與對照相比增加18.67% ～37.64%， 且不同品種間差異也顯著增大， 其中龍牧801 的可溶性蛋白含量顯著高于其他品種（P＜0.05）；凍脅迫下，龍牧801和公農2 號可溶性蛋白含量較高， 顯著高于皇后和賽迪（P＜0.05）。 上述結果表明，品種龍牧801和公農2 號可溶性蛋白的增加可有效增強細胞的滲透調節能力，從而提高苜蓿耐寒性，反之皇后和賽迪苜蓿可溶性蛋白積累量較少，抗寒性較弱。

圖2 苜蓿根系可溶性蛋白和SOD 活力變化

各品種根系的SOD 活性由39.53 ～40.96 U/g FW 升至47.66 ～55.15 U/g FW 又降至42.93 ～47.83 U/g FW。 冷脅迫時，各品種根系的SOD 活性呈現最高值，其中龍牧801 和公農2 號的SOD活性顯著高于其他品種（P＜0.05），而皇后和賽迪苜蓿的SOD 活性較低； 隨脅迫加劇，SOD 活力有所下降；凍脅迫下，龍牧801、公農2 號和草原3號的SOD 活性較高，與其他品種相比差異顯著（P＜0.05）。 該結果表明，抗寒品種更易增強SOD 酶活性，SOD 可通過歧化反應清除超氧陰離子自由基，進而提高苜蓿對低溫的適應能力。

2.3 丙二醛和相對電導率 由圖3 可知，各品種的丙二醛含量由起初的52.45 ～53.02 nmol/g 升高至64.53 ～97.42 nmol/g。 與對照相比，龍牧801和草原3 號冷脅迫下丙二醛上升較為緩慢， 而皇后和賽迪苜蓿的丙二醛迅速升高， 分別比對照增加37.90%和47.88%。 隨脅迫強度加劇，各品種在凍脅迫下丙二醛呈現最高值， 以品種皇后和賽迪苜蓿的丙二醛含量較高， 而龍牧801 和草原3 號的丙二醛含量顯著低于其他品種（P＜0.05）。

圖3 苜蓿根系丙二醛和相對電導率變化

越冬期各品種相對電導率隨冷凍脅迫增加呈現升高的變化， 相對電導率由8.16%～8.38%升至54.08%～70.70%。 與對照相比，各品種冷脅迫時的相對電導率增加252.12% ～366.70%； 凍脅迫時，各品種的相對電導率呈現最高值，以賽迪苜蓿的相對電導率最高， 顯著高于其他品種 （P＜0.05），而龍牧801、草原3 號和公農2 號的相對電導率較低。

2.4 綜合評價 相關性結果表明，苜蓿耐寒指標游離脯氨酸與SOD、可溶性糖、蛋白之間呈極顯著或顯著正相關，相關系數分別為0.916、0.869 和0.566，即脯氨酸含量越高，可溶性糖、蛋白、SOD的含量和活性增加， 細胞滲透調節和抗氧化能力增強，則苜蓿的耐寒性越強。丙二醛與相對電導率呈極顯著正相關（P＜0.01；0.851），說明低溫下品種的丙二醛含量越高， 則品種的細胞膜傷害程度較重，膜透性增大，相對電導率升高（表1）。 運用隸屬函數對品種的抗寒性進行綜合評價，最終得出抗寒強弱順序依次為： 龍牧801 （0.529）＞公農2 號（0.523）＞草原3 號 （0.514）＞皇后 （0.468）＞賽迪（0.463）（表2）。

表1 相關性分析

表2 隸屬函數分析

3 討論

滲透調節是植物通過積累脯氨酸、糖類、蛋白等物質使低溫下的植物細胞維持一定的膨壓，以減少細胞內水分的流失， 避免因結冰對植物細胞造成損害（邱乾棟等，2009）。 低溫下，植物細胞滲透調節過程的關鍵是細胞內溶物的主動積累（Haagenson 等，2003）。 由于滲透調節的暫時性和有限性，滲透調節并不能維持整個生理過程（郭子武等，2004）， 因此通過滲透調節抵御寒冷有一定的局限性。苜蓿遇冷脅迫時，組織可溶性糖含量表現為增加趨勢，抗寒品種龍牧801、草原3 號和公農2 號的可溶性糖含量顯著高于其他品種， 隨脅迫加劇，可溶性糖含量有所下降，這與陶雅和孫啟忠（2008）的研究結果相一致，說明抗寒品種之所以在寒冷環境中表現出強抗寒性， 與其自身積累較多的可溶性糖密切相關（孫予璐等，2017）。游離脯氨酸作為一種細胞滲透調節物質， 其積累與低溫相關，低溫脅迫下苜蓿游離脯氨酸普遍增加，本研究中， 冷脅迫下龍牧801 和公農2 號游離脯氨酸含量較高；隨脅迫加劇，游離脯氨酸含量有所降低，而龍牧801 的脯氨酸含量仍最高，說明品種在寒冷環境中細胞失水后， 可通過提高根系內游離脯氨酸的含量， 增加細胞液濃度以對根系細胞起保護作用， 即游離脯氨酸可作為細胞冰凍保護劑保護原生質體（王小華和莊南生，2008），低溫下，苜蓿可溶性蛋白變化趨勢類似于游離脯氨酸，也與抗性相關。 抗寒能力越強， 品種可溶性蛋白含量越高， 如龍牧801 在冷脅迫下可溶性蛋白積累量達到峰值，并且顯著高于其他品種，說明抗寒品種通過積累可溶性蛋白來增強根系保水能力，減輕低溫傷害（張麗娟，2008）。

低溫時， 膜系統尤其是作為連接細胞與環境界面的質膜為最初受害部位。 低溫凍害首先作用于質膜，通常表現為膜透性變大，電解質及小分子有機物滲漏（陳衛東等，2021）。丙二醛為膜系統的過氧化產物，其含量高低可反映植物受害程度。保護酶SOD 具有清除自由基的作用，其活力變化可作為植物的耐寒指標 （江福英等，2002；Mckersie等，2000）。本研究中，各品種丙二醛含量隨低溫脅迫加劇呈上升趨勢，相同低溫（凍脅迫）下與耐寒性弱的品種相比， 抗寒品種 （龍牧801 和草原3號）根系中丙二醛積累量和增幅較小，細胞膜損傷程度較輕，抗氧化能力較強。楊秀娟（2006）在研究苜蓿根莖與抗寒性的關系時指出，根莖中SOD 酶活性隨溫度降低呈先升后降變化趨勢。本研究中，越冬初期各品種SOD 活性增加迅速， 且品種間SOD 酶活性差異較大，如龍牧801 和公農2 號的SOD 活性最高； 隨脅迫加劇，SOD 酶活性有所降低但仍維持較高水平， 說明抗氧化酶活性與品種遺傳特性有關， 保護酶活力持久性能體現品種抗寒性（Brouwer 等，2000）。 越冬期不同苜蓿相對電導率隨溫度降低呈現增加趨勢，凍脅迫下，以賽迪和皇后相對電導率較高。 苜蓿抗寒性與低溫下細胞膜透性存在一定關聯， 抗寒品種可通過降低細胞膜透性以減輕傷害，進而增強根系耐寒能力，反之則非抗寒品種細胞膜透性增大， 相對電導率升高（王運濤等，2012）。 抗寒性越高的品種，其根系內游離脯氨酸、可溶性糖、蛋白含量與SOD 活性在冷凍脅迫下顯著高于其他品種。據此，越冬期根系內含物含量與活性的變化是鑒別品種抗寒性強弱的有效手段，經隸屬函數評定得出龍牧801、公農2 號和草原3 號為強抗寒品種。

4 結論

本試驗結果表明，隨地溫降低，根系內游離脯氨酸、可溶性糖、蛋白含量和SOD 活性呈先升后降的變化，丙二醛和相對電導率則呈上升趨勢。抗寒性強的品種根系內含物的含量和活性在低溫下顯著高于其他品種。簡言之，越冬期根系內含物含量與活性的變化是鑒定品種抗寒性強弱的有效手段， 依此排列的品種抗寒強弱順序依次為： 龍牧801＞公農2 號＞草原3 號＞皇后＞賽迪。