中草藥混菌固態發酵玉米秸稈飼料及工藝條件的研究

蔣 鑫， 沈 旭， 吳 波， 莊 勇， 劉林培， 何明雄

（1.成都理工大學生態環境學院，四川 成都 610059；2.農業農村部沼氣科學研究所，農業農村部農村可再生能源開發與利用重點實驗室，生物質能技術研究中心，四川 成都 610064）

玉米秸稈具有種植面積廣、 數量大及可生物降解等優勢，是畜牧業飼料的原料之一。根據農業農村部《全國農作物秸稈綜合利用情況報告》統計顯示，2021 年玉米秸稈產生量達到3.21 億t，位居農作物秸稈產生量第一。 而以往大部分玉米秸桿被直接還田或焚燒， 這給環境帶來了嚴重的負面影響，因此如何變廢為寶，高效率低成本地利用玉米秸稈， 已成為我國當前生物質資源利用領域的研發熱點。 目前玉米秸稈的綠色處理方式主要包括肥料化、飼料化及能源化等（Xu 等，2020；Gang等，2020）。隨著畜業的迅猛發展，飼料短缺已成為嚴重制約反芻動物生長的重要因素。 玉米秸稈含有較高的纖維素、半纖維素和木質素，若直接進行飼喂，消化利用率低，但經過微生物發酵后，玉米秸稈粗蛋白質含量增加，粗纖維含量減小，改善飼料適口性促進牲畜的生長并增強牲畜的免疫能力（伍玉鵬等，2022；Ren 等，2020）。高效率低成本地利用玉米秸稈為制作粗飼料來源提供巨大保障，一定程度上能夠緩解人畜爭糧及減少農村環境污染等問題（劉海燕等，2016）。

固態發酵期間， 大量腐敗微生物和不良微生物的滋生對發酵質量帶來極大的風險。 目前已有研究表明， 在黃貯或青貯制備中添加一定量的中草藥能夠顯著地降低這種風險（Liu 等，2011）。黃芪、馬齒覓等中草藥中含有多糖、類黃酮、酚類化合物、精油等生物活性物質，其對多種真菌和細菌具有顯著的抑制作用 （Qla 等，2021；Falleh 等，2020）。在紫花苜蓿中添加含有類黃酮和多糖等活性物質的中藥材，如黃芪、山楂等進行共青貯能夠抑制梭菌、腸桿菌及真菌，促進乳酸菌的生長，進而提高青貯品質（Ni 等，2020；Hashemi 等，2011）。He 等（2020）將辣木葉與稻草進行共青貯不僅能夠促進乳酸菌的生長， 也保障了青貯飼料的發酵品質和營養。 此外，Li 等（2022）發現，黃芪、馬齒覓等36 種中草藥與紫花苜蓿進行混合發酵能夠提高發酵體系中乳酸的濃度和乳酸桿菌的豐度。呂慧源等（2019）使用中草藥混合發酵后能夠顯著提高粗蛋白質含量。

本研究所使用的中草藥（黃連、黃芪、黃芩、馬齒覓、山銀花、雪膽、地黃）也含有豐富的多糖、類黃酮、酚類化合物、精油等生物活性物質，在農業農村部第194 號文件要求全面“禁抗” 的大環境下，可作為一種新型的飼料添加劑，具有與抗生素得相似或相同的功效，符合無抗養殖的要求。蛋白含量是飼料的一項重要指標， 粗蛋白質中包含蛋白質含量和非蛋白含量， 不能反映飼料的真正營養價值， 因此本研究在飼料發酵過程中主要探究尿素含量、含水量、菌液添加量、葡萄糖的添加量對飼料真蛋白含量的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試驗原料與輔料 玉米秸稈、 豆粕由中國農業科學院沼氣科學研究所提供，中草藥（黃連、黃芪、黃芩、馬齒覓、山銀花、雪膽、地黃）由成都中醫藥大學提供。 玉米秸稈用切碎機切至2 ～4 cm進行后續試驗。

1.1.2 試驗菌種 枯草芽孢桿菌（ACCC 19743）、植物乳桿菌（CICC 21804）購自中國農業微生物菌種保藏管理中心， 運動發酵單胞菌ZM-D95（GDMCC 60582）、釀酒酵母（CICC 32632）為農業農村部沼氣科學研究所秸稈資源化利用創新平臺保藏菌株。 枯草芽孢桿菌采用LB 培養基30 ℃、150 r/min 進行培養， 植物乳桿菌采用MRS 培養基30 ℃進行靜止培養，運動發酵單胞菌ZM-D95采用RM 培養基30 ℃進行靜止培養、釀酒酵母采用YPD 培養基30 ℃、150 r/min 進行培養。

1.2 主要儀器 凱氏定氮法儀 （KD-310 OPSIS公司）、石墨消解爐（SH220F 海能未來技術集團股份有限公司）、恒溫振蕩培養箱（THZ-98AB 一恒科學儀器有限公司）、 高效液相色譜儀（Agilent 1200 series 安捷倫科技有限公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱 （DHG-914OA 上海齊欣科學儀器有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（HVA-85 Sanyo 公司）、垂直層流潔凈工作臺（HCB-1300V 海爾集團）、紫外分光光度計 （DU800 Beckman 貝克曼庫爾特公司）、 酶標儀（美谷Molecular Devices 公司）、BioLector Ⅱ（貝克曼庫爾特公司）、粉碎機（BJ-300A德清拜杰電器有限公司）、 恒溫培養箱 （HZQX300 一恒科學儀器有限公司）、pH 計（FE28 梅特勒-托利多儀器有限公司）

1.3 主要試劑

1.3.1 培養基配方 RM 培養基：20.00 g/L 葡萄糖，10.00 g/L 酵母提取物（YE），2.00 g/L（NH4）2SO4，2.00 g/L KH2PO4，1.00 g/L MgSO4，若需要RM 固體培養基則需另添加15 g/L 的瓊脂。

MRS 培養基：蛋白胨10 g/L；牛肉浸粉8 g/L；酵母浸粉4 g/L；葡萄糖20 g/L；磷酸二氫鉀2 g/L；檸檬酸氫二銨2 g/L； 乙酸鈉5 g/L；硫酸鎂0.2 g/L；硫酸錳0.04 g/L；吐溫-80 1 g/L；若需要固體培養基則需另添加15 g/L 的瓊脂。

PDA 培養基：馬鈴薯浸粉5 g/L；葡萄糖20 g/L；瓊脂20 g/L；氯霉素0.1 g/L。

YPD 培養基： 蛋白胨20 g/L； 酵母提取物10 g/L；葡萄糖20 g/L；若需要YPD 固體培養基則需另添加15 g/L 的瓊脂。

LB 培養基：酵母提取物10 g/L；胰蛋白胨5 g/L；氯化鈉5 g/L。 若需要LB 固體培養基則需另添加15 g/L 的瓊脂。

麥康凱培養基：瓊脂15 g/L，蛋白胨20 g/L；氯化鈉5 g/L；乳糖10 g/L；結晶紫0.001 g/L；中性紅0.03 g/L；3 號膽鹽10 g/L； 上述YPD 培養基、PDA 培養基、MRS 培養基、RM 培養基在115 ℃滅菌20 min， 麥康凱培養基和LB 培養基在121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 試驗藥品 三氯乙酸、氫氧化鈉、硼酸、溴甲酚綠、甲基紅、鹽酸、濃硫酸、蒽酮、亞硝基鐵氰化鈉、葡萄糖、酵母提取物、高效凱氏定氮催化片、瓊脂等均為分析純級別。

1.4 試驗方法

1.4.1 單因素試驗 將2 ～4 cm 干玉米秸稈加入5%中草藥（m/m）、5%豆粕（m/m）、復合菌液（植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、運動發酵單胞菌，1：1：1：1）和葡萄糖，調整含水量，混合均勻按照150 g/袋，裝填至真空袋中，由真空機抽去空氣，30 ℃培養箱中密封發酵30 d， 各組試驗均重復三次。 發酵結束后進行取樣，將樣品烘干，經過除去非蛋白氮后進行凱氏定氮法測定蛋白質的含量， 以發酵過程中的真蛋白含量為指標確定最佳發酵條件。

1.4.2 正交試驗設計 在單因素試驗基礎上， 以水分含量、菌液添加量、葡萄糖的添加量作為變量因素設計三因素三水平L9（33）正交試驗進行發酵條件優化，以此來確定玉米秸稈飼料最佳發酵工藝條件。

1.4.3 正交結果驗證 將正交試驗優化得出的最佳發酵條件再次進行發酵，測定其真蛋白含量，并與正交試驗結果對比，確定其含量是否相近，驗證單因素試驗和正交試驗之間的可靠性。

1.4.4 添加中草藥對飼料的影響 取2 ～4 cm干玉米秸稈加入5%的豆粕 （m/m）、5%復合菌液（植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、運動發酵單胞菌，1：1：1：1）（V/m）、按照正交所得到的最佳發酵條件進行發酵，一組添加5%組方中草藥（m/m），另外一組以不添加中草藥作為對照組，充分混合均勻，按照150 g/袋，裝填至真空袋中，由真空機抽去空氣，30 ℃培養箱中密封發酵30 d，各組試驗均重復三次。發酵結束后測定真蛋白、粗蛋白質、有機酸含量以及相關微生物的數量。

1.5 指標測定及方法 稱取發酵后的飼料樣品20 g，加入180 mL 無菌水充分混合，混勻后在4 ℃下懸浮過夜，然后采用四層粗棉布過濾，最后所得濾液用于pH、氨氮和有機酸的含量測定。 氨氮采用Broderick 等（1980）報道的方法進行測定。 pH通過pH 計進行測定。 有機酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）采用高效液相色譜法（HPLC）分析。 該系統使用Aminex HPX-87H 色譜柱（300 mm×7.6 mm，安捷倫科技有限公司），HPLC 分析條件為： 流動相：0.05 mol/L H2SO4，流速：0.6 mL/min，柱溫：55 ℃，檢測器：示差檢測器，進樣品體積：20 μL。

另取40 g 發酵完成的飼料樣品， 放置于65 ℃通風烘箱 （DHG-914OA 上海齊欣科學儀器有限公司）干燥48 h 確定干物質（DM）含量，并研磨烘干樣品至能通過1 mm 篩子， 然后進行蛋白質組分測定。 測定之前先采用10%三氯乙酸進行預處理， 再按照國標GB/T 6432-2018 方法進行測定。可溶性碳水化合物采用蒽酮-硫酸法進行測定（Hasan，2015）。纖維素、半纖維素采用兩步酸水解法進行測定（Sluiter 等，2010）。

對于微生物菌數的測定， 取20 g 已發酵好的樣品與180 mL 無菌鹽水（0.85% NaCl）均勻混合，并連續稀釋（10-1、10-2、10-3）分別涂布于不同培養基上，30 ℃培養2 d 后進行細菌計數； 將稀釋10-3的稀釋液涂布到添加0.1 g/L 放線菌酮的MRS 瓊脂培養基上，以計數乳酸菌（LAB）數量；添加氯霉素的PDA 培養基上計數釀酒酵母和霉菌數量，在麥康凱培養基上計數大腸菌屬數量。菌落數為每克新鮮物質（FM）的菌落形成單位（CFU）中的細菌存活數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗對玉米飼料真蛋白含量的影響

2.1.1 尿素添加量對玉米飼料真蛋白含量的影響發酵條件如1.4.1，對照組（CK）不添加尿素；試驗組添加1%、2%、3%（m/m）的尿素；真蛋白與粗蛋白質含量測定結果見圖1。

圖1 尿素添加量對玉米秸稈飼料真蛋白和粗蛋白質含量的影響

試驗結果表明，發酵結束后，在添加尿素后粗蛋白質的含量先增加后減小， 在添加量為1% 時達到最高，與對照組相比提高了19.52%并且差異顯著（P＜0.05）（圖1a），而真蛋白含量先減少后增加，對照組的含量最高，但各組差異不顯著（P＞0.05）（圖1b）。

2.1.2 尿素含量對玉米飼料pH 和有機酸的影響表1 中測定結果顯示，隨著尿素添加量的增加pH也隨之增加， 添加量超過1%時，pH 高于4.5，差異顯著（P＜0.05），以往的研究表明飼料的有效保存pH 在4.5 以下。 乳酸作為飼料中的有益物質，其含量先增加再減小， 在尿素添加量為1%時達到最大，乳酸對比對照組提高了22.78%也具有統計學差異（P＜0.05），尿素添加量為1%時比較適宜。另外有研究表明，丁酸出現在飼料中是一種能量浪費代謝，在飼喂時會影響牲畜的采食率，其含量大于5 g/kg 會影響動物健康 （Muck，2010；Thomas 等，1991）。本試驗結果中僅對照組和添加量為1%時丁酸含量小于5 g/kg。 綜上所述真蛋白、粗蛋白質以及有機酸的含量，最終確定尿素的添加量為1%，這與Santos 等（2018） 得到的尿素最佳添加量結果相一致。

表1 尿素添加量對玉米秸稈飼料pH 和有機酸含量的影響

2.1.3 含水量對玉米秸稈飼料真蛋白含量的影響發酵體系中含水量對玉米秸稈飼料蛋白含量具有明顯的影響，發酵條件如1.4.1，調整每組中的水分含量為50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%；其真蛋白含量結果如圖2 所示。

圖2 含水量對秸稈飼料真蛋白含量的影響

結果表明， 當含水量由50%升高到65%，真蛋白含量由6.69%增加到6.86%； 而含水量由65%升高到80%， 真蛋白含量由6.86%下降到6.57%。 這表明含水量對真蛋白含量具有顯著影響（P＜0.05），推測可能由于水分含量影響了細菌在該環境中的生長繁殖。 此外， 試驗結果表明，65%含水量是該環境下的發酵最佳含量。因此，選取60%、65%、70%含水量進行發酵優化。

2.1.4 菌液添加量對飼料真蛋白含量的影響 發酵條件如1.4.1，對照組（CK）不接種菌液；試驗組接種1%、2%、3%、4%、5%的復合菌液（植物乳桿菌、枯芽孢桿菌、釀酒酵母、運動發酵單胞菌按照1：1：1：1）；其結果圖3 所示。

圖3 菌液添加量對玉米秸稈飼料真蛋白含量的影響

結果表明，菌液添加量從0% ～2%，真蛋白含量由6.10%增加到6.80%； 添加量從2% ～5%時，真蛋白含量由6.80%下降至6.49%。 這表明菌液添加量對真蛋白含量也是具有明顯的影響（P＜0.05）。 試驗結果顯示，2%的菌液添加量對于真蛋白含量的影響最為顯著（P＜0.05），其真蛋白含量對比對照組提升11.64%， 因此選擇1%、2%、3%進行后續條件優化。

2.1.5 葡萄糖含量對玉米秸稈飼料真蛋白含量的影響 發酵條件如1.4.1，對照組（CK）不添加葡萄糖；試驗組添加4%、6%、8%、10%（m/m）的葡萄糖。其結果如圖4 所示。

圖4 葡萄糖添加量對玉米秸稈飼料真蛋白含量的影響

試驗結果顯示， 隨著葡萄糖添加量的增加（0% ～10%），真蛋白含量變化呈現先上升后下降的趨勢； 其中6%葡萄糖添加量時真蛋白含量最高， 相較于對照組其真蛋白含量增加19.68%，具有顯著差異（P＜0.05）。 這表明6%葡萄糖添加量更加適合用于發酵。 因此選擇4%、6%、8%的葡萄糖添加量進行后續條件進一步優化。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗結果分析 將上述所得到的優化條件含水量60%、65%、70%， 菌液添加量1%、2%、3%，葡萄糖添加量4%、6%、8%進行正交試驗設計，如表2 所示。

表2 正交試驗設計與結果

由表2 可知， 三個因素對真蛋白含量的影響程度依次為含水量＞葡萄糖添加量＞菌液接種量，最佳發酵工藝條件為A3B3C3，即含水量為70%，葡萄糖含量為8%，菌液添加量為3%。

2.2.2 正交試驗結果驗證 以正交試驗所得最佳發酵條件含水量70%，葡萄糖含量8%，菌液添加量3%進行發酵。 發酵結束后進行取樣， 樣品烘干， 經過除去非蛋白氮后進行凱氏定氮法測定真蛋白質的含量，測得其真蛋白的含量為7.47%；這與正交試驗結果的真蛋白含量結果具有一致性，表明組方中草藥混菌固態發酵玉米秸稈飼料工藝單因素試驗和正交優化試驗結果可靠。

2.3 組方中草藥對玉米秸稈飼料的影響 發酵工藝如2.2，其余發酵條件如1.4.1。 對照組（-TCH）不添加中草藥；試驗組（+TCH）添加5%（W/W）的中草藥。 將發酵結束的飼料樣品進行后續微生物計數、pH 和有機酸含量以及飼料品質成分測定。

2.3.1 中草藥對微生物群落的影響 從表3 中可以看出，試驗組（+TCH）中乳酸菌數比對照組（-TCH）的乳酸菌數量更多，增加15.10%，具有顯著的差異 （P＜0.05）， 這與He 等 （2020）、Liu 等（2011）結果一致；而對照組（-TCH）霉菌和大腸菌屬的數量雖均高于試驗組（+TCH），但不具有顯著性差異（P＞0.05）。 這可能是由于添加中草藥后能夠促進乳酸菌的生長（楊君等，2009），而乳酸菌不僅能夠產生大量的乳酸，還能分泌一些抗菌肽，進而抑制該環境中霉菌、 釀酒酵母以及大腸菌屬等腐敗菌的滋生，起到了穩定發酵體系的作用。

表3 中草藥對飼料微生物的影響lg CFU/g FM

2.3.2 中草藥對玉米秸稈飼料pH 和有機酸的影響 表4 中試驗結果表明，試驗組（+TCH）乳酸含量比對照組（-TCH）更高，對比對照組（-TCH）提高了17.84%，這也與前面試驗組（+TCH）乳酸菌的數量比對照組 （-TCH） 高相一致， 試驗組（+TCH）pH 也更低。

表4 中草藥對飼料成分的影響

2.3.3 中草藥對玉米秸稈飼料品質的影響 從表5 中可以看出，試驗組（+TCH）中粗蛋白質、真蛋白含量以及干物質量比對照組（-TCH）分別提高21.69%、10.93%、0.5%，但均不具有統計學上的顯著性差異（P＞0.05）；添加中草藥后能夠確保發酵體系更穩定，營養物質對比對照組（-TCH）含量更高且保存更完好。同時試驗組（+TCH）中纖維素和半纖維素含量比對照組（-TCH）分別降低3.10%和4.52%， 這可能是添加中草藥后抑制了腐敗菌的滋生，確保了枯草芽孢桿菌的生長與發酵環境，而其分泌產生的纖維素酶降解纖維素， 降低了纖維素和半纖維素含量； 另外一個原因可能是由于尿素對纖維素和半纖維素也具有部分溶解作用（伏桂華等，2021）。

表5 中草藥對飼料品質的影響

3 結論

本研究通過設計正交試驗優化混菌固態發酵玉米秸稈飼料的最佳工藝條件為： 含水量70%，葡萄糖添加量8%，菌液添加量3%，尿素添加量1%。該條件下混菌固態發酵玉米秸稈飼料中真蛋白含量為7.47%， 且添加中草藥后能夠增加乳酸菌數量和乳酸含量， 進而抑制腐敗菌霉菌和大腸菌屬的滋生， 同時也降低了纖維素和半纖維素的含量。 因此， 飼料發酵中添加中草藥進行混合固態發酵對于提高飼料質量具有相當的可行性。