枯草芽孢桿菌發酵銀杏葉制備飼料添加劑的工藝研究

宋立立 ， 董旭芳， 張連水

（1.滄州師范學院生命科學系，河北 滄州 061001；2.河北省水產養殖微生物菌劑技術創新中心，河北 滄州 061001）

目前，人們飲食和保健意識日益升高，在選擇食用禽類、畜類產品時，越來越注重安全、保健及無農藥殘留。 而抗生素在動物飼料的泛濫使用嚴重危害動物及人類健康，因此發酵安全飼料產品，利用合適的方法發酵禽畜飼料已成為當前重點任務（高樹封，2014）。枯草芽孢桿菌廣泛分布在土壤或腐敗物中，作為一種需氧型革蘭氏陽性菌，是一種實驗室及工業飼料常用菌種（杜曉雨等，2020）。此菌種也廣泛應用在改善動物腸道菌群方面（盧超等，2020）。 利用枯草芽孢桿菌發酵飼料可以產生大量活性物質， 從而促進轉化吸收和增強動物機體免疫力（蘇偉光，2020），并且研究表明用發酵飼料飼養的反芻動物效果更明顯（白海等，2020）。

銀杏屬銀杏科銀杏屬， 銀杏樹作為我國特有速生珍貴藥用植物多地區均有栽培。 銀杏葉及其提取物中含大量黃酮、有機酸、多酚、多糖及氨基酸等活性物質，藥用價值廣泛，作為禽畜類飼料的優選來源，為動物的代謝及生長提供營養（李志平等，2021；宋立立等，2020）。 但若直接將銀杏葉添加到飼料中飼養動物，因口感味道不佳，動物取食性不高（高樹封，2014）。本試驗采用從銀杏葉粉當中直接提取黃酮、多酚、多糖與枯草芽孢桿菌實驗室固態發酵銀杏葉，優化發酵工藝條件，在最適發酵工藝條件下測定黃酮、多酚及多糖的含量對比，旨在改善銀杏葉口感來喂養動物。 一方面發揮銀杏葉的價值，另一方面提高家禽、家畜的生產率及產品安全性， 為以后工業微生物發酵銀杏葉制備飼料添加劑做出理論指導。

1 試驗材料及設備

1.1 試驗菌株 枯草芽孢桿菌（保藏菌種）。

1.2 試驗材料及藥品試劑 試驗材料： 銀杏葉粉、豆粕、麩皮；藥品試劑：牛肉膏、瓊脂、酵母膏、蛋白胨、L-酪氨酸、干酪素、吐溫（20、40、60、80）、無水乙醇、NaOH、HCl、NaCl、NaNO2、Al （NO3）3、MgSO4、K2HPO4、KH2PO4、福林酚試劑、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等。

1.3 培養基 斜面培養基： 牛肉膏、 蛋白胨、瓊脂、NaCl。 種子培養基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%（m/V）、pH 7.4、121 ℃滅菌20 min。 基礎發酵培養基：每個錐形瓶內銀杏葉粉7 g、豆粕1.5g、麩皮1.5 g、營養液20 mL、121 ℃滅菌30 min。接菌量5%。 營養液：蛋白胨10.0 g/L、K2HPO46.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、酵母膏0.4 g/L、自然pH。

2 試驗方法

2.1 菌株活化和培養 將實驗室的菌種轉接于固體培養基， 置于恒溫培養箱37 ℃條件下培養22 h，使其活化?；罨玫慕臃N于種子培養基37 ℃、160 r/min 進行培育， 之后以5%接種量接種于固態發酵培養基進行發酵。

2.2 粗酶液的制取 將產物至于室內通風處風干， 用分析天平量1 g 樣品至100 mL 錐形瓶中，20 mL 無菌生理鹽水和3 顆無菌小球， 放置搖床37 ℃、200 r/min 條件下30 min 后進行離心，得粗酶液。

2.3 蛋白酶活測定 以酪蛋白為底物，參照國標Folin-酚法測定蛋白酶活性（楊旭等，2014）。

酪氨酸標準曲線繪制：取適量L-酪氨酸和蒸餾水，配制濃度為0.1 mg/mL 的L-酪氨酸標準溶液， 分別取0、1、2、3、4、5、6 mL 標準溶液定容至10 mL。 分別依次加入NaCO3、Folin-酚試劑，搖勻，放入水浴鍋內。 顯色20 min 后，測OD 值。 繪制標準曲線， 得回歸線方程：y=0.0466x+0.0233，R2=0.9969。

2.4 單因素試驗 以蛋白酶的活性為指標，探究固態發酵銀杏葉的溫度、時間、接菌量、營養液酸堿度以及表面活性劑因素的關系。

2.4.1 發酵溫度對發酵產品中酶活力的影響 參照原始條件，分別設置四批發酵，溫度分別為31、34、37、40 ℃。 做三組平行，檢測每個發酵溫度條件下培養基的蛋白酶活， 確定培養基的最適發酵溫度。

2.4.2 發酵時間對發酵產品中酶活力的影響 參照原始條件，設定發酵時間分別為24、36、48、60 h，做三組平行， 檢測每個發酵時間條件下培養基蛋白酶活，確定培養基的最適發酵時間。

2.4.3 接種量對發酵產品中酶活力的影響 參照原始條件，改變接菌的數量分別為6%、8%、10%、12%，做三組平行。分別檢測各種條件下的蛋白酶性質，確定出發酵條件的最適接菌數量。

2.4.4 營養液pH 對發酵產品中酶活力的影響參照原始條件， 改變營養液酸堿度的值分別為6.5、7.0、7.5、8.0。 分別檢測各種條件下蛋白酶活，從而找出最優的發酵酸堿度（冒鑫哲等，2020）。

2.4.5 不同表面活性劑對發酵產品中酶活力的影響 參照基礎發酵培養基，分別添加0.5%的不同系列吐溫；分別檢測不同系列吐溫下的酶活力，確定出培養基的最適發酵活性劑（王東等，2016）。

2.5 黃酮、多酚含量的提取及測定方法

2.5.1 黃酮、多酚提取方法 分別取出3 g 發酵后的產物和銀杏葉粉，以C2H5OH 作為萃取劑，在1:30的料液比條件下180 W 超聲30 min，將所得混合液進行抽濾， 即得到待測樣品溶液 （成宏斌等，2021）。

2.5.2 黃酮含量的測定 量取待測液5 mL 于玻璃試管中。 各試管中分別加入1 mL 亞硝酸鈉搖勻靜置6 min。 加入1 mL 硝酸鋁溶液，搖勻放置6 min，再加入NaOH 10 mL，用蒸餾水定容至25 mL，放置15 ～20 min。 設置波長為510 nm，測OD 值（A）。 根據y=8.3884x+0.002，R2=0.9993 得黃酮濃度，計算含量（圖1）。

2.5.3 多酚含量得測定 沒食子酸標準曲線：取沒食子酸配制濃度為0.1 mg/mL 的液體。 用儀器分別取0 ～1.0 mL （等差為0.2 mL） 溶液于試管中， 分別添加1 mL Folin-酚試劑， 搖勻放置5 min。 加入NaCO33 mL，混勻定容至10 mL。 遮光30 min，760 nm 處測吸光度（姜湘英等，2020），得出回歸方程y=189.1x-0015， 相關系數R2=0.9978（圖2）。 取樣品1 mL 于試管，空白管加蒸餾水做對照，分別添加1 mL Folin-酚試劑、20%NaCO33 mL，定容至10 mL。搖勻遮光30 min。將測得的OD 值代入方程得多酚濃度，找出含量。

圖2 沒食子酸標準曲線

2.6 多糖的提取及測定 取葡萄糖配制成0.04mg/mL溶液，分別取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于8 支試管， 分別加水至2.0 mL， 添加1 mL 苯酚，混勻。再加入濃H2SO4，靜置20 min，測OD 值。曲線圖和方程見圖3。

圖3 葡萄糖標準曲線

分別稱取2 g 發酵產物和銀杏葉粉，加入20 mL蒸餾水煮沸1 h， 八層紗布過濾后5000 r/min 離心。 取上清液加等體積20% CCl3COOH 后搖勻于冰箱冷藏30 min。 高速離心后取上清液按1：4 加入80% C2H5OH， 混勻放置24 h。 繼續離心留沉淀，用無水C2H5OH 洗下并烘干。 將干燥后的物質溶解至100 mL， 取2 mL 液體， 加入6%苯酚1 mL，混勻。 添加濃H2SO4，依照葡萄糖標準曲線方法，測OD 值代入方程，查出濃度，計算多糖含量（秦令祥等，2018）。

3 結果分析

3.1 單因素分析

3.1.1 發酵溫度對蛋白酶活力的影響 由圖4 可見，從31 ℃到37 ℃，隨著發酵溫度的上升，蛋白酶活逐漸升高。 到37 ℃表現最高酶活力為42.41 U/mL。繼而隨著培養箱設置溫度越來越高， 酶活力開始逐漸下降。 由此確定發酵銀杏葉最合適的培養箱溫度為37 ℃。

圖4 溫度對蛋白酶活的影響

3.1.2 時間對蛋白酶活力的影響 設定發酵培養時間分別為20 ～60 h（等差為12 h）四個梯度，從前兩天的48 h 期間，活力顯著提高，隨著發酵培養時間繼續延長至60 h， 蛋白活力由最高46.98 U/mL 下降至40.55 U/mL。由此確定枯草芽孢桿菌影響銀杏葉發酵的最佳時長為48 h（圖5）。

圖5 發酵時間對蛋白酶活的影響

3.1.3 接種量對蛋白酶活力的影響 改變種子液接菌數量， 發現不同接種量相對于發酵時間和溫度來說， 其對酶的活力影響較大。 從6%升高到10%的接菌標準時，酶活力持續上升。接菌數量達到10%的時候，活力達頂峰為83.64 U/mL（圖6）。隨著接菌量的提高， 推測錐形瓶內營養或氧氣含量不足，其可能為酶活變低的原因。 由此，可確定出發酵培養時接菌的數量為10%。

圖6 接種量對蛋白酶活的影響

3.1.4 營養液pH 對發酵產品中酶活力的影響由圖7 可知， 關系到蛋白活力的最顯著營養液酸堿度為7.5。 調節不同pH，由pH 6.5 時的蛋白酶活為44.36 U/mL，營養液pH 調節到7.5 時的蛋白酶活為64.36 U/mL。 繼續提高酸堿度為8 時，蛋白酶活反而下降。

圖7 營養液pH 對蛋白酶活的影響

3.1.5 活性劑對發酵產品中酶活力的影響 由圖8 可知， 不同系列的吐溫產品對蛋白酶活的影響不明顯，添加吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60 發酵條件下，測得蛋白酶活相似。 吐溫-80 效果較顯著，此時蛋白酶活力為53.61U/mL。

圖8 表面活性劑對蛋白酶活的影響

3.2 響應面結果分析 通過單因素試驗結果比較發現， 對發酵銀杏葉的結果影響最顯著的三個因素，分別為接種量、營養液pH 和發酵時間。 因此， 借助Desgin Expert 11 軟件對響應面進行設計，進而對三因素三水平進行分析（表1）。

表1 響應面因素與水平

對枯草芽孢桿菌發酵銀杏葉產酶的三個因素進行17 組分析試驗， 繼續測定蛋白酶活。 使用Desgin Expert 11 對測驗所得的響應值蛋白酶活力進行二次多變量回歸擬合，得二次多元方程為Y =103.86 +0.24A -0.4025B +1.6C -0.885AB -1.84AC+0.755BC-6.82A2-9.08B2-3.72C2。 其中Y為預測的蛋白酶活值，A 為接種量，B 為營養液pH，C 為發酵時間。

根據軟件分析結果顯示，如表2，預測蛋白酶活的最大值可達到104.033 U/mL，各因素分別為A=-0.0103%、B=-0.0124、C=0.2149， 換算實際值為：接種量9.9763%、營養液pH 7.4924、發酵時間50.6633 h。

表2 響應面試驗設計分析

3.2.1 回歸分析 針對二次多變量回歸方程顯著性和方差結果進行分析（表3）。 此模型P=0.0005（P＜0.01），擬失項P=0.8503（P＞0.05）。 此結果可以得出結論，此模型回歸極為顯著，而擬失項不顯著。該模型的R2=0.9572，表示擬合程度較好，可以準確預測不同發酵條件下所產生的蛋白酶活。

表3 二次模型方差分析

3.2.2 各因素等高線圖和響應曲面 使用軟件Design-Expert 11 對三個因素分析， 導出關于接種量、營養液pH 以及時間三個因素之間模型的等高線圖和響應曲面圖。交互作用的顯著性可以利用等高線圖來反映。 等高線圖結果顯示越扁，代表交互作用越顯著；等高線圖越近乎圓環時，則代表其交互作用不顯著（陳作國等，2018；王東等，2016）。

因此由圖9 ～11 可以看出， 交互作用中，營養液pH 和發酵時間最為顯著， 接種量和發酵時間影響次之，而接種量和營養液pH 則最不顯著。

圖9 接種量-營養液pH影響蛋白酶活等高線圖、響應曲面圖

圖10 接種量-發酵時間影響蛋白酶活等高線圖、響應曲面圖

圖11 營養液pH-發酵時間影響蛋白酶活等高線圖、響應曲面圖

3.3 驗證試驗 為了檢測模型預測結果的可靠性，采用優化后近似值的培養基（接種量10%、營養液pH 7.5、發酵培養時間50.67 h）做3 組平行發酵試驗， 并繼續測定枯草芽孢桿菌發酵銀杏葉培養基的蛋白酶活力大小， 結果分別為104.48、101.19、100.38 U/mL，平均值為102.02 U/mL。 驗證結果表明， 發酵后測得蛋白酶活實際值與此響應面優化預測值相差較小。 該優化后的模型非常好地預測了實際蛋白酶活力值，預測結果可信。

3.4 最優發酵產物及直接測定銀杏葉黃酮、多酚、多糖含量 結合單因素試驗，選取最優條件下的發酵培養基，再次進行發酵試驗。取發酵產物和銀杏葉粉，提取并測定黃酮、多酚、多糖三者的含量。 結果表明，最優發酵條件下，黃酮、多酚、多糖含量分別為13.94、1.2、6.26 mg/g；對銀杏葉粉直接提取黃酮、多酚、多糖，其三者含量分別為15.43、1.37、7.2 mg/g。

4 結論

枯草芽孢桿菌發酵銀杏葉制備飼料添加劑，可以很好地利用銀杏葉的價值。 黃酮類化合物可以促進動物生長發育， 影響動物體內性激素的分泌和代謝及其他激素的調節，可提高免疫機能，促進健康。 多酚可以改善動物生產性能、預防疾病，屬于純天然無污染無耐藥性的抗生素代替物，多糖可以提高飼料的適口性。

本試驗通過對銀杏葉粉直接提取黃酮、多酚、多糖并測定其含量， 以及利用枯草芽孢桿菌進行實驗室固態發酵， 改變發酵工藝進行單因素試驗初步對發酵條件進行優化，利用Design-Expert 11軟件對單因素試驗結果進一步優化。 最終得出結果，對銀杏葉粉直接提取黃酮、多酚、多糖，其三者含量分別為15.43、1.37、7.2 mg/g；枯草芽孢桿菌發酵銀杏葉的蛋白酶活最佳條件為接種量9.98%、營養液pH 7.49、發酵培養時間50.66 h，結合單因素試驗， 發酵溫度為37 ℃， 表面活性劑為0.05%的吐溫-80， 該發酵狀態下測得蛋白酶活為106.78 U/mL，提取并測得黃酮、多酚、多糖含量分別為13.94、1.2、6.26 mg/g。試驗結果顯示，發酵后物質含量有所下降，但是相差不大。而且發酵后的飼料適口性更好， 有利于促進動物生長發育。