外周血腦細胞來源細胞外囊泡作為中樞神經系統疾病生物標志物研究進展

張高嘉， 孔 巖， 李 玲， 焦 嬌， 徐丹丹， 曹育嘉， 劉夢雨綜述， 張志珺，3審校

本篇綜述首先概述了細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），同時對目前使用的用于富集外周血不同 腦細胞來源細胞外囊泡（brain cell-derived extracellular vesicles，BCDEVs）特異性分子標記物進行概述，最后重點介紹了外周血BCDEVs 在中樞神經系統（centralnervous system，CNS）疾病中的應用，以闡明其作為生物標志物的潛力，以及它們在實現這一目標時所面臨的挑戰。

1 EVs概述

EVs 是一組由各種類型的細胞經過多個不同階段的演變釋放到細胞外環境的納米級異質性脂質雙層膜囊泡［1，2］，存在于所有人體體液中，包括CSF、血液、尿液、母乳和唾液等［3～8］，其內包含幾乎所有類別的生物分子，如核酸（細胞核及線粒體DNA、長鏈RNA 和miRNA）、蛋白質（結構蛋白和/或酶蛋白）、代謝物和脂類［9，10］，其內容物的不同取決于它們的起源細胞和該細胞所處的生理及病理狀態［1，11，12］，這些不同分子在調節一系列生物過程的細胞-細胞通信中發揮重要作用［13～17］。在過去十年間，人們對EVs 的類別和特征及其生理和病理作用的認識不斷加深，根據其大小及生物起源不同主要分為3 種類型：外泌體、微囊泡（microvesicles，MVs）和凋亡小體［18］。凋亡小體是由細胞程序性死亡形成的最大的膜性囊泡（500～4 000 nm），凋亡細胞經歷多個階段的演變，最終導致包裹在不同的膜結合囊泡中的細胞內容物的破壞形成凋亡小體［19，20］，常以腔內存在細胞器和/或核內容物為特征。雖然通常與EVs無關，但在各種條件下，溶酶體囊泡分泌或分泌性自噬等非常規分泌過程可能會將大量細胞質基質釋放到細胞外環境中而形成與EVs相似的膜性囊泡結構［21］。MVs，也稱胞外體、微粒或脫落囊泡，大小為100～1 000 nm，直接由質膜向外出芽形成［22］，MVs 與凋亡小體的區別不僅在于大小，還在于它們的形成、內容物和膜特異性抗原。外泌體是一種由多泡體（multive bodies，MVB）與胞膜融合后分泌到細胞外環境的一組直徑介于30～150 nm 的含有特殊標記物的膜性小囊泡［23，24］，其表面或腔內含有特殊標記物包括Alix、TSG101、HSC70、HSP90、CD81、CD9、CD63 等［15，25］。外泌體起初被認為是一種細胞廢棄物［26］，然而隨著研究技術的進步，人們發現外泌體代表了一種新的細胞間通訊方式，并參與了廣泛的生理和病理過程［15］。MVs和外泌體在大小上存在重疊，雖然根據他們的生物發生過程可以明確區別不同類型EVs，但到目前為止，由于缺乏特定的標記和技術方法，還沒有一種策略可以在復雜的生物流體樣本中對這兩種類型的EVs 進行無可爭議的表征和/或物理分離［27～30］，因此本綜述中，使用總體術語EVs進行表述。

2 用于富集外周血不同BCDEVs 特異性分子標記物

BCDEVs 是由不同神經細胞分泌的含有來自其生成細胞生物分子的細胞外納米囊泡，在外周血血漿或者血清中可通過不同EVs特異性表面標記物富集不同亞型BCDEVs，這為CNS 疾病的診斷及療效評估開辟了新的范式。來自華盛頓大學西雅圖分校的Zhang 團隊［31］和加州大學舊金山分校的Goetzl 團隊［32］首先開創了這一領域，分別先后建立了外周血NDEVs 的富集方法。目前用于富集外周血NDEVs特異性分子標記物有L1 細胞黏附分子（L1-Cell adhesion Molecule，L1CAM）［33～35］、神經細胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）［36，37］和突觸體相關蛋白-25（synaptosomal associated protein-25，SNAP25）［38］，其中L1CAM 分子是最常用的外周血NDEVs 特異性分子標記物。最近來自浙江大學的Zhang團隊又新鑒定了一種分子標記物N-甲基-D-天冬氨酸受體2A（N-methyl-D-aspartate receptor 2A，NMDAR2A），發現NMDAR2A 與L1CAM 共同存在于NDEVs，可被用于富集外周血NDEVs 特異性分子標記物［33］。隨后Goetzl 課題組又創建了外周血ADEVs的富集方法［39］，目前用于富集外周血ADEVs 特異性分子標記物多采用谷氨酰胺天冬氨酸轉運體［glutamine aspartate transporter，GLAST（又稱作astrocyte cell surface antigen-1，ACSA-1［39］或excitatory amino acid transporter 1，EAAT1［38］）］，目前報道的僅有一項研究同時使用水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）和膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）用于分離血漿ADEVs［40］。隨后華盛頓大學西雅圖分校的Zhang 團隊［41］和日本京都醫科大學Tokuda 團隊［38］分別采用不同的特異性分子標記物［前者使用2，3-環核苷酸-3-磷酸二酯酶（2，3-cyclic nucleotide-3-phosphodiesterase（CNPase），后者使用少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMG）］創建了外周血ODEVs富集方法。由威克森林醫學院Deep 團隊利用小膠質細胞特異性分子標記物I 型跨膜蛋白119（Type-I transmembrane protein 119，TMEM119）成功建立了食蟹猴外周血MDEVs 富集方法［42］，隨后東南大學神經精神研究所Zhang 團隊首次利用TMEM119 在人血漿中分離MDEVs［43］。最近來自威克森林醫學院Deep 團隊又分別利用PDGFRβ 和CD31 建立了外周血血漿PDEVs 和EDEVs［44］。雖然目前已經建立了利用特異性分子標記物富集外周血不同BCDEVs 方法，然而用于分離各種BCDEVs 特異性分子標記物并非各自神經細胞所特有，在其他類型細胞中也都有表達。如L1CAM 蛋白不僅在神經元中表達，在腎臟和脂肪組織中也有表達［38］，同時最近的一項研究表明，存在于人血漿中的L1CAM 可能與NDEVs 無關［45］。因此迫切需要尋找更加特異性的不同腦細胞分子標記物用于富集外周血不同亞型BCDEVs。

3 外周血BCDEVs 作為CNS 退行性疾病生物標志物研究

3.1 阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）

3.1.1 外周血BCDEVs 作為AD 診斷生物標志物 外周血BCDEVs 作為一種新興的生物標志物已引起大家廣泛關注，通過檢測這些囊泡所包含的生物分子和數量變化，可為AD 的早期診斷提供新途徑。既往研究發現，與對照組相比，AD 患者血漿NDEVs 內T-Tau、P-T181-Tau、P-S396-Tau、Aβ1-42［7］、P-Tau231、pSer312-IRS-1、pY-IRS-1［46］、組織蛋白酶D（Cathepsin D）、溶酶體相關膜蛋白1（lysosomeassociated membrane protein 1，LAMP-1）、泛素化蛋白、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）［47］、突觸素、突觸足蛋白、突觸結合蛋白-2、神經粒蛋白（neurogranin，NRGN）、生長相關蛋白43（growthassociated protein 43，GAP-43）、突觸蛋白酶1（synapsin 1）［48］、TDP-43［49］、miR-132-3p、miR-212［50］、血清NDEVs 內SNAP-25［51］、血漿ADEVs 內C1q、C4b、C3d、因子B、因子D、Bb、C3b、C5b-C9 末端補體復合物、白介素-6、腫瘤壞死因子α 和IL-1β 水平發生顯著改變［52］，其中P-S396-Tau、P-T181-Tau、Aβ1-42、組織蛋白酶D、LAMP-1、泛素化蛋白、HSP70、神經素蛋白2α（neurexin 2α，NRXN2α）、谷氨酸GluA4 受體和磷酸化IRS-1 等候選分子甚至可在AD 臨床發病1～10 年前出現異常［32，46，47，53，54］，在一項起始認知功能正常平均隨訪3.5 年后進展為AD 的大樣本研究中發現，與認知功能正常對照組相比，起始認知功能正常后進展為AD 患者血漿NDEVs 直徑增大，囊泡內PTau181、P-Tau231、pSer312-IRS-1 和pY-IRS-1 水平升高，對AD 疾病預測準確度高達89.6%（敏感性=81.8%，特異性=85.8%）［46］。并且突觸結合蛋白、突觸素和NRGN 水平高低與簡易智力狀態檢查（minimental state examination，MMSE）及AD 評估量表-認知子量表（AD assessment scale-cognitive subscale，ADAS-cog）評分顯著相關，具有較高的疾病診斷效能，其診斷準確度高達82.6%（敏感性=87.5%，特異性=70.6%）［48，51］，這些BCDEVs內候選分子由于受到脂質雙分子層的保護，具有較高的穩定性［55］，與腦組織［50］或CSF［36］中存在一致性差異性改變。除了囊泡內候選分子，研究者還發現AD 患者血漿NMDAR2A陽性EVs 濃度較對照組明顯下降［33］，血漿NDEVs 直徑顯著增大［46］。以上結果表明，外周血NDEVs 或ADEVs 及其內分子具有代表中樞作為AD 診斷生物標志物潛能，具有較高的診斷靈敏性和特異性。

3.1.2 外周血BCDEVs 作為AD 鑒別診斷生物標志物 外周血BCDEVs 除了可作為AD 潛在診斷生物標志物外，其內一些候選分子還可作為AD與其他認知功能障礙性疾病包括遺忘型輕度認知功能損害（amnestic mild cognitive impairment，aMCI）和FTD等鑒別診斷生物標志物。研究發現，與aMCI患者相比，AD 患者血漿NDEVs 內Aβ42、T-Tau 和P-T181-Tau 水平顯著升高［36］，與FTD 患者相比，AD 患者血漿NDEVs內組織蛋白酶D、LAMP-1和泛素化蛋白水平顯著升高［47］。與對照組相比，AD 患者血漿NDEVs 內GAP-43 和突觸蛋白酶1 水平下降，而在FTD 患者中未發現上述分子異常［48］。AD 患者血漿ADEVs 中β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE-1）和可溶性淀粉樣前體蛋白β（soluble amyloid precursor protein β，sAPPβ）水平明顯高于正常對照組，膠質細胞源性神經營養因子（glial-derived neurotrophic factor，GDNF））水平明顯低于正常對照組，但在FTD 中未觀察到血漿ADEVs中上述3種蛋白存在差異性表達［39］。同時另一項研究發現，AD患者胰島素抵抗水平（P-serine 312-IRS-1/P-pantyrosine-IRS-1）顯著高于FTD 患者，且在臨床發病前1～10 年，AD 患者胰島素抵抗水平已明顯高于FTD患者［54］。

3.1.3 外周血BCDEVs 作為AD 進展及預后生物標志物 既往研究發現，在AD 發病前6～11 年的臨床前期，血漿NDEVs中NRXN2α、谷氨酸GluA4受體和神經素1（Neuroligin 1，NLGN1）水平較正常對照均顯著降低，并且其水平高低隨癡呆進展而顯著下降［53］，而在另一項經過5～12 年隨訪后確診為AD 的縱向隊列研究中發現，AD 患者血漿ADEVs 中補體調節蛋白CD59、CD46、衰變加速因子和1 型補體受體水平顯著低于對照組，這些補體分子在AD起始認知功能正常階段就已降低，隨著認知功能損害的加重其水平進一步降低［52］。以上結果提示上述血漿BCDEVs 中候選分子可作為AD 疾病進展及預后生物標志物。

3.1.4 外周血BCDEVs 作為AD 風險預測生物標志物 外周血BCDEVs 還可作為疾病預測性診斷生物標志物，糖尿病患者輕度認知功能障礙（Mild cognitive impairment，MCI）發病風險增加，并可增加MCI向AD 轉化風險［56～58］，Zhang 等人［59］研究發現，與2-型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）認知功能正常組相比，T2DM 合并AD 或進展MCI 患者血漿NDEVs 內NADH 泛醌氧化還原酶核心亞基S3（NADH ubiquinone oxidoreductase core subunit S3，NDUFS3）和琥珀酸脫氫酶復合亞基B（Succinate dehydrogenase complex subunit B，SDHB）水平顯著降低，同時與T2DM 穩定MCI 患者相比，T2DM 進展MCI患者血漿NDEVs 內NDUFS3 和SDHB 水平下降，并且在隨訪期間，血漿NDEVs 內低NDUFS3 和SDHB水平與進展MCI 患者海馬和灰質萎縮率及AD 特征性皮質厚度降低相關［59］。在對MCI 轉化為AD 的預測性生物標志物研究中發現，與3 年內MCI 穩定組相比，3 年內MCI 轉化為AD 患者組血漿ADEVs 中C1q、C4b、因子D、Bb 片段、C5b、C3b 和C5b-C9 水平顯著升高，抑制性CPs衰變加速因子、CD46、CD59和1 型補體受體水平顯著降低［60］。而在另一項研究中發現，與認知正常對照和穩定MCI 患者相比，MCI 轉化為AD 患者血漿NDEVs 中P-S396-Tau、P-T181-Tau和Aβ1-42 水平顯著升高，而NRGN 和抑制因子1 沉默轉錄因子水平顯著降低，同時作者將MCI 轉化為AD 患者血漿NDEVs 注射到小鼠海馬CA1區后可明顯增加該腦區P-Tau 陽性細胞數比例［61］。以上結果表明，外周血BCDEVs 有作為T2DM 或MCI 向AD 疾病轉化風險預測性診斷生物標志物，同時將AD患者血漿NDEVs 注射到小鼠海馬CA1區后P-Tau 陽性細胞數比例增高，也進一步證明了囊泡內致病性蛋白的存在，為利用外周血BCDEVs 作為介質研究AD 潛在發病機制提供可能依據。

3.1.5 外周血BCDEVs 作為探索AD 潛在發病機制生物標志物 Goetzl 等人通過對血漿ADEVs 和NDEVs 中Aβ42 肽生成系統系列蛋白成分定量分析后發現，AD 患者血漿ADEVs 中BACE-1、γ-分泌酶、可溶性Aβ42、sAPPβ、sAPPα、GDNF、P-T181-Tau 和P-S396-Tau水平均顯著高于血漿NDEVs中各相應蛋白水平［39］，提示ADEVs 中豐富的Aβ42 肽生成系統系列蛋白可能在維持神經元內Aβ42 肽生成系統蛋白動態平衡發揮關鍵作用，為AD關于神經細胞之間相互作用在疾病發病機制研究中提供了新思路［39］。既往研究表明，AD 患者腦內存在神經元自噬-溶酶體功能障礙［62，63］，研究者通過對AD患者血漿NDEVs內不同類型溶酶體蛋白進行定量分析后發現，在AD診斷前的數年里，血漿NDEVs 中組織蛋白酶D、LAMP-1、泛素化蛋白和HSP70 溶酶體蛋白水平存在顯著性差異改變，以上結果進一步證明了AD患者在疾病早期階段可能已出現神經細胞自噬-溶酶體通路功能障礙［47］。在另一項研究中，Kapogiannis 等人在發現來自AD 患者外周血ADEVs 中補體水平整體升高后［52］，隨后在另一項研究中，將外周血免疫富集的ADEVs 和NDEVs 作用于大鼠元代皮質神經元和人誘導性多能干細胞（human-induced pluripotent stem cells，h-iPSCs），使用多種細胞和分子實驗技術驗證后發現，AD 患者血漿ADEVs 可通過激活補體誘導神經元上膜攻擊復合物表達，引起神經元細胞膜破壞和神經突密度降低，從而引起大鼠元代皮質神經元和h-iPSCs 細胞活力降低，并在另一組經尸檢診斷的AD 患者中得到進一步的驗證［64］。以上結果表明ADEVs 可通過補體介導的途徑對神經元細胞產生直接損傷作用，為深入了解AD病理生理機制提供了新思路，同時循環中ADEVs 很容易被神經元內化吸收，這也促使改良ADEVs 在AD 腦靶向治療中的應用，為將來藥物研發提供一定的啟示。既往研究表明，AD 的疾病進展和嚴重程度與保護神經元抵抗不同應激轉錄因子缺乏有關［65，66］，Goetzl等人通過對AD 患者血漿NDEVs 內介導神經元抵抗不同應激的細胞存活因子定量分析后發現，AD 患者血漿NDEVs內介導神經元抵抗不同應激的細胞存活因子包括低密度脂蛋白受體相關蛋白6、熱休克因子-1和阻遏元件1沉默轉錄因子水平均顯著降低［67］，該研究表明，AD 患者腦內神經元病理性死亡可能與神經元存活所需細胞存活因子缺失有關，揭示了神經元細胞外囊泡中細胞存活因子水平降低與AD發病機制之間的潛在關系，為AD的治療提供了新的思路和方向。

3.2 突觸核蛋白病

突觸核蛋白病是一組以錯誤折疊的α-syn 沉積在神經元及神經膠質細胞為主要病理特征的臨床和病理學異質性疾病，主要包括帕金森病（parkinson disease，PD）和多系統萎縮（multisystem atrophy，MSA）等［68］。目前關于外周血BCDEVs 在突觸核蛋白病中作為生物標志物研究主要圍繞致病性蛋白α-syn 展開，顯示出較好的疾病診斷、預測及療效評估效果。

3.2.1 帕金森病（Parkinson disease,PD）

3.2.1.1 外周血BCDEVs 作為PD 診斷生物標志物 既往研究表明，外周血BCDEVs中α-syn、DJ-1和Lnc-POU3F3 水平異常可作為PD 診斷生物標志物［31，69］。Zhang 等人研究發現，與HC 相比，PD 患者血漿NDEVs 中α-syn 水平顯著升高，血漿NDEVs 內α-syn 與統一帕金森病評定量表（Unified Parkinson's Disease Rating Scale，UPDRS）之間存在顯著相關性（r=0.176，P=0.004），并且血漿NDEVs 中α-syn 水平在區分PD患者與對照組敏感性和特異性接近CSF α-syn［31］。而在另一項研究中，Liu 等人發現，與HC 相比，早期PD血漿NDEVs中a-syn水平顯著升高，并且與PD 患者UPDRS Ⅲ/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）評分（r=0.29，P=0.04；r=0.36，P=0.01）、非運動癥狀問卷評分（r=0.30，P=0.039）和Sniffin Sticks 16 項評分（r=-0.29，P=0.04）相關［69］。而在另一項聯合多中心、大樣本及多隊列研究中發現，無論是發現隊列還是驗證隊列，與對照組相比，PD患者血清NDEVs中α-syn水平均顯著升高，在區分PD 和對照組方面兩隊列表現出一致的準確性，ROC 分析AUC 均達到了0.86（發現對列：敏感性=82%，特異性=71%；驗證隊列：敏感性=85%，特異性=74%）［34］。除了a-syn，研究者還對外周血BCDEVs 中其他潛在候選分子包括DJ-1 和Lnc-POU3F3 進行定量分析，以評估其作為PD 診斷生物標志物潛能。在一項橫斷面隊列研究中，Wang 等人發現，與對照組相比，PD 患者血漿NDEVs 中DJ-1 和a-syn 水平同步顯著升高，同時NDEVs 中DJ-1 與asyn顯著正相關（r=0.902，P＜0.001）［70］。而在另一項橫斷面研究中，Zou 等人發現，與對照組相比，PD 患者血漿NDEVs 中Lnc-POU3F3 和a-syn 水平同步顯著升高，并且與α-syn 顯著正相關（r=0.658，P=0.009）［71］。以上結果表明，血清或血漿NDEVs 中α-syn、DJ-1與Linc-POU3F3可作為PD潛在診斷生物標志物。

3.2.1.2 外周血BCDEVs 作為PD 鑒別診斷生物標志物 在一項聯合多中心、大樣本、橫斷面及縱向隊列研究中，Tofaris 等人［34］對多種神經變性譜系疾病包括路易體譜系疾病［包括快動眼睡眠行為障礙（rapid eye movement sleep behaviour disorder，RBD）、運動性PD、PD 伴癡呆、DLB、MSA］和其他類型神經退行性病變［包括FTD、進行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy，PSP）和皮質基底節變性（corticobasal syndrome，CBS）］血清NDEVs 內syntenin-1、clusterin 和α-syn 3 種蛋白水平進行定量分析后發現，RBD、PD 和DLB 患者血清NDEVs 中α-syn升高的水平約是MSA 或其他蛋白病包括FTD、PSP 和CBS 的2 倍，差異有顯著性。而與RBD、PD 和MSA 相比，FTD、PSP 和CBS 患者血清NDEVs 中clusterin水平顯著升高。血清NDEVs中α-syn在鑒別PD和其他非典型帕金森綜合征具有較高的效能，ROC分析AUC 為0.85（敏感性=0.80，特異性=0.74），聯合α-syn 和clusterin 可顯著提高PD 與其他非典型帕金森綜合征鑒別診斷效能，ROC 分析AUC 為0.98（敏感性=0.94，特異性=0.96），即使在PD 發病前驅期也具有較高的鑒別診斷效能（RBD vs 其他非典型帕金森綜合征，AUC=0.98，敏感性=0.95，特異性=0.93）［34］。而在另一項橫斷面研究中，Dutta 等人發現，聯合血清/血漿NDEVs 和ODEVs 中α-syn 可以更好的區分PD 和MSA 患者，與MSA 患者相比，PD 患者血清/血漿NDEVs 和ODEVs 中α-syn 水平均顯著下降，與NDEVs 中α-syn 相比，ODEVs 中α-syn 水平可以更好的區分PD 和MSA 患者，其ROC 分析AUC為0.87（敏感性=73.0%，特異性=82.7%）。而當聯合NDEVs 和ODEVs 兩種BCDEVs 后，即ODEVs 中α-syn/NDEVs 中α-syn，其鑒別PD 和MSA 兩種疾病效能更高，其ROC 分析AUC 為0.90（敏感性=89.8%，特異性=86.0%），具有較高的鑒別診斷靈敏性和特異性［72］。

3.2.1.3 外周血BCDEVs 作為PD 進展生物標志物 Tofaris 等人對PD 患者進行平均（40.3±8.5）個月隨訪后發現，血清NDEVs 中α-syn 隨著PD 疾病進展而穩定升高［34］，而Liu 等人進一步研究發現，在對早期PD 患者進行平均22 個月隨訪后發現，與基線血漿NDEVs 內a-syn 水平相比，Cox 回歸分析顯示血漿NDEVs內a-syn水平的縱向升高與PD運動癥狀進展相關（hazard ratio=8.92，95%CI1.10～71.4，P=0.039）［69］。以上結果表明，血漿NDEVs中a-syn水平可作為PD疾病進展潛在生物標志物。

3.2.1.4 外周血BCDEVs 作為探索PD 藥物治療潛在作用機制生物標志物 在一項關于PD 隨機安慰劑對照研究中發現，艾塞那肽可通過調節胰島素信號通路改善PD運動功能［73］，為了探索艾塞那肽改善PD 運動功能潛在作用機制，MRCP 等人通過血清NDEVs 評估艾塞那肽改善PD 患者運動功能是否與接受艾塞那肽治療后PD患者腦胰島素和Akt信號通路活性增強有關［35］。研究者富集接受艾塞那肽-PD試驗的60 例受試者血清NDEVs，并對其內腦胰島素和Akt 信號通路蛋白進行定量分析后發現，與接受安慰劑治療PD 患者相比，艾塞那肽治療48 周時PD患者血清NDEVs 內酪氨酸磷酸化IRS-1 及其下游底物包括總Akt和磷酸化雷帕霉素機制性靶點（mechanistic target of rapamycin，mTOR）表達升高，同時血清NDEVs 中總mTOR（F4，50=5.34，P=0.001）和磷酸化mTOR（F4，50=4.38，P=0.04）與UPDRS 中第三部分非藥物治療評分的改善顯著相關。本研究結果表明，艾塞那肽改善PD 患者運動功能可能通過使PD 患者腦胰島素信號傳導正常化并與腦內Akt 和mTOR 級聯的激活有關［35］。這為以后使用靶向神經元通路的藥物進行臨床試驗時，使用基于NDEVs 生物標志物闡明藥物靶點參與提供了一種簡單實用的方法。

3.2.2 MSA 不同于PD 病理特點為α-syn 聚集在神經元細胞為主，MSA患者腦內病理性α-syn主要聚集在少突膠質細胞，因此，Zhang 等人對MSA 患者血漿ODEVs 水平及其內α-syn 進行定量分析，以評估其作為MSA 診斷及鑒別診斷生物標志物潛力。與PD 患者相比，MSA 患者血漿ODEVs 濃度顯著下降，且具有較好的疾病診斷能力（MSA vs. HC，AUC=0.85，敏感性=3.9%，特異性=71.9%）和鑒別診斷能力（MSA vs. PD，AUC=0.77，敏感性=61.8%，特異性=81.3%）。與PD 患者相比，MSA 患者血漿ODEVs 內α-syn 水平顯著降低，隨后通過一系列細胞及動物實驗證明導致MSA 患者血漿ODEVs內α-syn水平降低原因是由中樞分泌進入外周血漿中ODEVs 數量減少引起，而與每個ODEVs 中裝載的α-syn 數量無關。為了驗證MSA 患者中樞到達外周血漿ODEVs 減少潛在機制，研究者在MSA 轉基因小鼠和原代少突膠質細胞中進一步驗證了導致MSA 患者血漿ODEVs數量減少可能與腦內α-syn 過量表達聚集介導的干擾syntaxin4 和VAMP2 之間的相互作用，進而導致可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感融合因子附著蛋白受體復合物的功能障礙，最終引起少突膠質細胞MVB 釋放過程障礙［41］。以上結果表明，血漿ODEVs 及其內α-syn 水平具有作為MSA 診斷及鑒別診斷生物標志物潛力，MSA 患者血漿中減少的ODEVs 可能與少突膠質細胞病理性α-syn 聚集增加有關，然而外周血ODEVs 作為MSA 生物標志物的潛力仍需要進一步的探索。

4 外周血BCDEVs 作為多發性硬化（multiple sclerosis，MS）生物標志物研究

MS 是一種免疫介導的中樞神經系統脫髓鞘疾病，約15%患者表現為原發進展型MS（primary progressive MS，PPMS）［74，75］，臨床中對于MS 分型診斷仍較困難，為了尋找MS 不同亞型生物標志物，Agliardi等人對MS 患者不同亞型［臨床孤立綜合征（clinically isolated syndrome，CIS）、PPMS和復發緩解型MS（relapsing remitting MS，RRMS）］及HC 血清ODEVs中髓鞘堿基蛋白（myelin basic protein，MBP）進行定量分析，探討其作為MS分型診斷和預后生物標志物潛力。結果顯示，與HC 相比，CIS（P＜0.001）、RRMS（P＜0.001）和PPMS（P＜0.001）血清ODEVs中MBP濃度顯著升高，此外，與RRMS（P=0.004）和CIS（P=0.03）相比，PPMS 患者血清ODEVs 內MBP 濃度顯著增加。HC 與MS 患者（CIS、RRMS 和PPMS）血清ODEVs 中MBP 水平ROC 分析AUC 為0.96（敏感性=97.84%，特異性=100.00%），PPMS 與RRMS+CIS 血清ODEVs 中MBP 水平ROC 分析AUC 為0.80（敏感性=66.67%，特異性=87.50%）。Pearson 相關性分析顯示，血清ODEVs 中MBP 水平分別與擴展殘疾狀態量表（r=0.32，P＜0.01）和多發性硬化嚴重程度評分（r=0.32，P＜0.01）顯著正相關。以上結果表明血清ODEVs 中MBP 水平可作為MS 分型診斷和監測疾病進展潛在生物標志物。

5 外周血BCDEVs 作為創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）生物標志物研究

TBI是指大腦遭受外部機械力創傷后引起腦部功能紊亂的復雜性疾病，世界范圍內，每年約5 000多萬人罹患TBI，約一半人口一生中會發生一次或多次TBI［76］，目前已成為世界性公共衛生問題。TBI后引起的慢性腦功能紊亂包括認知障礙（cognitive impairment，CI）、慢性腦震蕩及創傷后應激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD），尤其是對于運動員或者軍人等在訓練或者參加軍事行動過程中較易發生輕中度TBI 的特殊人群，往往由于缺乏臨床癥狀及影像學表現而診斷困難，因此臨床中急需尋找一些可靠輕中度TBI 診斷生物標志物，以便早期發現，早期干預。

Goetzl 等人分別納入了年齡在18～26 歲1 周內發生運動相關的急性輕度TBI（mild TBI，mTBI）、超過3個月發生2～4次運動相關慢性mTBI及HC，富集上述受試者血漿NDEVs。與HC 相比，僅急性mTBI血漿NDEVs 濃度顯著降低，并且其內一系列神經功能性腦蛋白包括ras 相關的小GTPase10、annexinⅦ、泛素C 末端水解酶L1、AII 血影蛋白片段、claudin-5、氯化鈉-鉀協同轉運蛋白-1 和AQP4 水平相較于HC 顯著異常，表現為不同程度地升高或降低［77］。隨后Goetzl 等人又探討了慢性TBI 對CI 患者血漿NDEVs 內蛋白水平的影響，結果發現，在TBI 后3～12 個月內，與TBI無CI患者相比，TBI合并CI患者血漿NDEVs內細胞朊病毒蛋白、突觸素-3、P-T181-Tau、P-S396-Tau 和Aβ42 水平顯著升高，而claudin-5、annexin Ⅶ和AQP4在有無TBI合并CI兩組患者中均未升高［78］。而在隨后的體外細胞實驗中，Winston等人［79］發現TBI患者血漿NDEVs 中存在高水平Aβ42，可對體外培養的神經元細胞產生細胞毒性作用，可損壞神經元細胞膜的完整性，進一步證明了TBI 患者血漿NDEVs 中神經退行性變生物標志物的存在［79］。以上結果提示急慢性TBI 可能引起大腦不同病理學改變，這為運動相關mTBI誘導的神經退行性病變尋找可供參考的病因學上的生物標志物提供新思路。同時血漿NDEVs 中神經退行性變相關蛋白的異常，為TBI介導的CI潛在藥物開發提供新的治療靶點。

隨后Goetzl 等人通過對TBI 患者血漿ADEVs 內神經毒性補體蛋白水平定量分析，探討補體介導的TBI 潛在發病機制。發現急性TBI 后血漿ADEVs 水平下降，并在幾個月內恢復正常。與HC 相比，急性TBI血漿ADEVs內經典途徑C4b、替代途徑因子D和因子Bb、凝集素途徑甘露糖結合凝集素、共享神經毒性效應物C3b 和C5b-9 末端C 復合物水平顯著升高，并且在隨后長達數十年時間里一直維持在較高水平［80］。以上結果表明補體系統的激活可能參與了TBI的病理，提示開發補體抑制劑可能對急性TBI有治療作用。

為了尋找外周血中與TBI 后慢性腦震蕩和PTSD相關生物標志物，Gill等人［81］對軍人mTBI血漿NDEVs 內Tau、Aβ42、TNFα、IL-6 和白介素-10（IL-10）水平進行定量分析后發現。與無mTBI 組相比，mTBI 組血漿NDEVs 內Tau、Aβ42 和IL-10 水平顯著升高，回歸分析顯示mTBI 后腦震蕩癥狀與NDEVs內Tau 蛋白升高相關（B=0.70，t=2.95，P＜0.01），PTSD癥狀與NDEVs內IL-10水平升高相關（B=0.8，t=2.60，P＜0.01）。這些發現表明Tau 蛋白可能參與mTBI 后慢性腦震蕩癥狀病理，同時也提示mTBI 后PTSD 可能與中樞炎癥活動增強有關，為炎癥可能參與TBI后慢性PTSD提供新證據［81］。

6 外周血BCDEVs作為MDD生物標志物研究

WHO 已將MDD 列為全球殘疾的最大單一因素［82，83］。既往研究發現MDD 患者血液中神經遞質、色氨酸代謝物、內分泌激素、免疫細胞因子以及生長和神經營養因子的濃度與HC 相比存在顯著差異［84～87］，這些基于血液生物標志物研究增加了對MDD 相關病理生理的理解，但這些變化通常缺乏疾病特異性和關于MDD 嚴重程度或對治療反應變化的預測能力。最近發表的一些文章評估了從MDD患者血漿或血清富集的NDEVs 或ADEVs 中潛在生物標志物，例如IRS-1［88］、線粒體蛋白［89］、外泌體大小和miRNA［90］以及炎性分子［91］，為客觀識別MDD及其潛在發病機制提供了新思路。

Rong等人比較了MDD（70例）和HC（70例）血清ADEVs 內多個炎癥因子變化后發現，與HC 相比，MDD 患者血清ADEVs 中干擾素-γ、IL-12p70、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α 和IL-17A 均顯著增加，單個炎癥因子ROC 分析AUC 介于0.52～0.70 之間，聯合上述多個差異表達炎癥因子ROC 分析AUC 為0.92（95%CI0.860～0.974），然而，多重比較校正后，MDD 患者上述差異表達炎癥因子與發病年齡、病程、當前發作時間和抑郁嚴重程度等臨床特征之間無相關性［91］。

既往研究表明，外周血BCDEVs 及其內容物可作為MDD 抗抑郁治療反應生物標志物。Goetzl 等人［89］在一項共納入20 例MDD 患者小樣本臨床研究中，通過觀察接受8 周選擇性血清素再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）治療前后MDD 患者血漿NDEVs 中14 種功能性線粒體蛋白包括線粒體動力和功能維持類蛋白、線粒體能量產生類蛋白、線粒體代謝和細胞存活類蛋白和線粒體生物發生類蛋白變化后發現，與HC 相比，MDD 患者SSRI 治療前基線期血漿NDEVs 內控制線粒體生物發生和許多抗氧化基因反應的轉錄2 型核呼吸因子（transcriptional type 2 nuclear respiratory factor，NRF2）、親環素D、線粒體融合蛋白2、亮氨酸拉鏈EF-手含跨膜1 蛋白的鈣通道/鈣通道增強劑成分、線粒體連接蛋白突觸親蛋白、肌球蛋白Ⅵ、內膜電子傳遞復合物Ⅰ和Ⅲ、煙酰胺單核苷酸腺苷酸轉移酶2、神經元線粒體代謝調節和保護因子人蛋白和線粒體12S rRNAC開放閱讀框蛋白均顯著降低，而促神經退行性NADase 不育α 和含有TIR 基序的蛋白質1 水平顯著升高。在對SSRI治療有反應的MDD患者中，除復合物Ⅰ、NRF2和PPAR γ 輔激活劑-1α 外，其他線粒體功能蛋白水平恢復正常，而在對SSRI治療無反應MDD患者中，上述血漿NDEVs 線粒體功能蛋白水平未見改變［89］。而在另一項研究中，Saeedi 等人分別從兩個時間點（基線和隨訪8 周后）對艾司西酞普蘭治療有反應（n=20）和無反應（n=20）MDD 患者血漿NDEVs分析后發現，與HC 相比，未經治療MDD 血漿NDEVs平均直徑變小，蒙哥馬利抑郁量表（montgomery-asberg depression rating scale，MADRS）評分變化與平均NDEVs 大小隨治療的變化之間存在顯著相關性（r=-0.196，P＜0.01），同時血漿NDEVs 內miR-423-3p、miR-191-5p、miR-486-5p、miR-30d-5p、miR-425-5p、miR-25-3p、miR-21-5p、miR-335-5p 和miR-126-5p 水平隨抗抑郁治療反應發生顯著性差異改變，miR-21-5p、miR-30d-5p 和miR-486-5p 三條miRNA 組合預測MDD 患者艾司西酞普蘭抗抑郁治療反應ROC 分析AUC為0.83（敏感性=76%，特異性=84%）［90］。以上結果表明，MDD 患者血漿NDEVs大小和其內線粒體蛋白和miRNA 水平的改變可作為評估抗抑郁藥物反應生物標志物。

胰島素信號轉導對神經可塑性、大腦代謝及全身能量代謝都至關重要［92～95］，既往研究表明，胰島素抵抗參與MDD 病理生理過程［96，97］。Nasca 等人通過對MDD 患者血漿NDEVs及其內IRS-1和絲氨酸-312磷酸化IRS-1（pSer-IRS-1）定量分析后發現，與HC 相比，MDD患者血漿NDEVs濃度增加，NDEVs內IRS-1水平升高，并且IRS-1 水平的升高與MDD 患者自殺和快感缺失相關［88］。這些發現為建立腦胰島素抵抗機制框架提供了新見解，也為進一步MDD 藥物治療開發提供新的藥物靶點依據。

7 外周血BCDEVs 作為其他精神性疾病生物標志物研究

除了探索BCDEVs 作為MDD 潛在生物標志物外，研究者還探索BCDEVs 作為其他精神性疾病包括首發精神病（first-episode psychotics，FP）、壓力誘發疲勞障礙（stress-induced exhaustion disorder，SED）和雙相情感障礙（bipolar disorder，BD）潛在生物標志物價值。

在一項小樣本病例對照研究中，Goetzl 等人［98］對10名未經治療FP患者血漿ADEVs和NDEVs內神經線粒體電子傳遞蛋白和補體蛋白進行定量分析后發現。與HC 相比，FP 患者血漿ADEVs 和NDEVs 中NADH-泛醌氧化還原酶（復合物Ⅰ）的亞基1和6以及細胞色素b-c1 氧化酶（復合物Ⅲ）的亞基10 水平顯著降低。與HC 相比，FP 患者血漿ADEVs 中膠質纖維酸性蛋白和C3b 調節蛋白水平顯著升高，神經保護蛋白白血病抑制因子水平顯著降低［98］。隨后Goetzl 等人又對FP 患者血漿NDEVs 和ADEVs 內線粒體神經保護蛋白進行定量分析后發現。與HC 相比，FP 患者血漿ADEVs 和NDEVs 內線粒體融合蛋白2、親環素D、線粒體短開放閱讀框神經保護及代謝調節肽人蛋白和線粒體12S rRNA-C 開放閱讀框蛋白水平顯著降低［99］。而在另一項對FP 患者血漿NDEVs 中線粒體鈣離子通道蛋白水平研究發現，與HC相比，FP患者血漿NDEVs中亮氨酸拉鏈EF-手含跨膜1 蛋白、瞬時受體電位陽離子通道亞家族M 成員4 和溶質載體家族8 成員B1 或線粒體Na+/Ca2+交換物的水平顯著降低，而電壓依賴的l型鈣通道亞基α-1C水平顯著升高［100］。以上結果表明血漿BCDEVs內線粒體蛋白和補體蛋白水平可能有助于預測FP，有助于了解FP 背后潛在發病機制，同時為探尋FP潛在藥物治療靶點提供新思路。

越來越多的證據表明，神經炎癥與BD的發病有關，TNF-α 拮抗劑英夫利昔單抗可改善BD 和兒童虐待史個體亞群抑郁癥狀［101］。為了探索英夫利昔單抗抗抑郁作用機制介質，Mansur 等人分別富集55 例成人BD在基線和治療第2周、6周、12周（終點）血漿NDEVs，對其內的細胞炎癥因子進行定量分析后發現，英夫利昔單抗可通過TNFR1、NF-κB 和NF-κB 抑制劑的時間相互作用來改善合并兒童虐待史BD 患者抑郁樣癥狀，在英夫利昔單抗治療患者中，血漿NDEVs 內TNFR1 水平降低與MADRS 評分降低相關，在第6 周（r=0.672，P=0.005）比第2 周（r=0.849，P=0.985）或第12 周（r=0.801，P=0.128）更明顯，同時TNFR1 水平降低與整體大腦皮質厚度增加相關（r=-0.581，P=0.029）。以上結果提示，英夫利昔單抗可能以兒童期創傷依賴的方式參與BD 患者TNFR/NF-κB神經炎癥通路［102］。

綜上所述，外周血BCDEVs 包含的多種與疾病相關生物分子和數量變化在CNS 疾病的早期診斷、鑒別診斷、疾病預測、預后評估以及疾病機制研究方面扮演著重要的角色，顯示出較好的診斷、預后及療效評估等潛力，然而，這些生物標志物的特異性和敏感性仍需進一步研究和驗證，尤其需要大規模多中心臨床研究來驗證其作為生物標志物的可靠性、準確性和臨床應用價值。同時目前基于BCDEVs 生物標志物研究尚處于實驗室研究起步階段，具體的BCDEVs 在腦內如何包裝致病性蛋白及EVs 如何從中樞轉運到外周的潛在機制尚不清楚。然而盡管如此，基于血液的中樞來源的生物標志物有可能徹底改變臨床過程中識別和監測患者的方式，代替進行一系列冗長而繁瑣的檢測，開發一種分析血液中多種疾病相關蛋白質組合的單一方法，將提高外周血BCDEVs 在臨床試驗中對患者試驗和結果監測的診斷準確性。同時基于外周血BCDEVs 研究，也可早期確定某些藥物治療的有益和/或有害結局，進而可以指導制藥公司和其他研究人員在進行臨床試驗前期初步了解藥物對疾病的影響，以提高藥物研發效率。同時由于EVs 可雙向通過BBB，可以制造攜帶信號分子、藥物或小干擾RNA的EVs，將這些化合物通過BBB運輸到腦部，以靶向特定的細胞亞型，這將克服BBB 本身對大腦運送的限制，并提供良好的生物相容性、高靶向特異性和低免疫原性［103］。

8 基于外周血BCDEVs研究面臨的挑戰

雖然基于外周血BCDEVs 是一個迅速發展和極具前景的研究領域，然而，要使這些分析成為測量CNS 疾病生物標志物的標準方法，還需要克服諸多挑戰。如上所述，為了富集外周血BCDEVs，需尋找更加特異性BCDEVs標記物，如由Zhang等人鑒定的L1CAM 分子雖然顯示出神經元細胞起源特異性［31］，并在多個研究中被證實［90，104］，然而，目前已知L1CAM 也在某些腫瘤和其他一些細胞如腎細胞中表達［105］，雖然目前沒有直接證據表明外周血中L1CAM 陽性EVs 是從腎臟和其他外周細胞類型中分泌，同時最近一篇研究甚至認為血液中L1CAM 可能與NDEVs 無關［45］。同樣，其他CNS 不同腦細胞包括星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞來源特異性EVs 表面標記物，以及來自受不同CNS 疾病影響的不同大腦區域的特異性分子標記物也應進一步探索，以確定對每種CNS 疾病更加特異性的生物標記物候選分子。因此，識別更具有CNS 特異性或特定于腦細胞亞群或特定腦區的EVs表面標記物是本領域目前面臨的重要挑戰之一。外周血BCDEVs研究另一個面臨的挑戰是EVs的分離和表征。雖然目前已建立多種EVs 分離和表征方法，但這些分離和表征方法都有各自的局限性，并且大多數分離和表征方法還沒有建立標準化流程，使得該領域無法具體定義不同研究人員所研究的EVs 亞群，這也解釋了為何不同課題組實驗結果的不一致性［32，36，106］。因此，未來可進一步開發用于單個EVs 分離和表征的新技術，使用多個標記分子準確可靠地分析單個EVs具有許多優勢，如減少污染信號/噪聲，減少對樣品材料的要求，以及更容易定位EVs亞群，以便更快速、敏感和準確地對EVs進行分析。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：張高嘉負責設計論文框架、收集文獻、起草論文和論文修改；孔巖、李玲、焦嬌、徐丹丹、曹育嘉和劉夢雨論文修改；張志珺負責對文章的知識性內容作批評性審閱及論文修改。