TREM2促進(jìn)心肌梗死后心肌細(xì)胞再生的機(jī)制研究

錢(qián)陳慧鈺,黃子鑒,傅 聰

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 心內(nèi)科,安徽 蕪湖 241001;2.皖南醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心,安徽 蕪湖241002)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年升高,也是造成居民死亡的主要因素之一。既往的觀點(diǎn)認(rèn)為心肌細(xì)胞是終末期細(xì)胞,無(wú)法再生。但隨著近年來(lái)研究的不斷深入,心肌細(xì)胞是終末期細(xì)胞這一觀點(diǎn)不斷受到挑戰(zhàn)。越來(lái)越多的研究認(rèn)為心肌細(xì)胞在特定的微環(huán)境下可以重新進(jìn)入細(xì)胞周期,開(kāi)始有絲分裂[1-2]。因此,闡明心肌細(xì)胞再生的機(jī)制和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)對(duì)改善心肌梗死(myocardial infarction,MI)后心肌細(xì)胞凋亡,恢復(fù)心臟收縮功能,進(jìn)而改善患者的心功能具有重要意義[3]。

髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2(triggering receptor expressed on myeloid cells-2,TREM2)屬于免疫球蛋白超家族的跨膜受體。在小鼠肺缺血再灌注損傷模型中,TREM2可以作為一種保護(hù)性因子參與調(diào)控早期炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[4]。之前的研究發(fā)現(xiàn)TREM2可預(yù)防缺血性心肌損傷,促進(jìn)MI后的心肌細(xì)胞存活[5]。因此,本研究旨在探討TREM2在MI后發(fā)揮心臟保護(hù)作用的機(jī)制。

細(xì)胞周期素A2(CyclinA2)是調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵蛋白,從S期到早期有絲分裂都高表達(dá)。通過(guò)激活細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶Cdk1和Cdk2促進(jìn)有絲分裂的啟動(dòng)[6]。有研究表明將CyclinA2基因遞送到梗死的豬心臟會(huì)引起心肌細(xì)胞有絲分裂增加、心肌細(xì)胞數(shù)量增加和纖維化減少[7]。為此,本研究通過(guò)MI患者臨床血漿樣本檢測(cè)和小鼠MI模型探討MI后TREM2是否可以通過(guò)CyclinA2促進(jìn)心肌細(xì)胞再生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠,8～10周齡,質(zhì)量20～25 g,購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。許可證號(hào)為SCXK(蘇)2018-000。TREM2-/-小鼠購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房(12 h∶12 h光照下飼養(yǎng),可以自由獲取食物和水)。

1.2 主要試劑 HE染色試劑盒和Masson三色染色試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司;BCA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所;β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自biosharp生物有限公司;CyclinA2抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司;PrimeScriptTM RT試劑盒和TB Green Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司;TREM2、CyclinA2和β-actin引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 TREM2血漿濃度檢測(cè) 采集弋磯山醫(yī)院心內(nèi)科住院的經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影(CAG)確定的10例MI患者外周靜脈血,8名年齡與性別匹配的無(wú)冠心病患者作為對(duì)照組。使用人TREM2 SimpleStep ELISA試劑盒(Abcam,英國(guó))檢測(cè)血漿TREM2濃度。

1.4 MI模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、野生型小鼠MI組和TREM2-/-小鼠MI組,每組6只小鼠。采用左前降支(LAD)永久結(jié)扎法建立AMI模型[8]。通過(guò)腹腔注射戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉并插管。在第4肋間打開(kāi)胸腔,暴露心臟。用7-0縫線在距左心耳2～3 mm處結(jié)扎LAD,左心室前壁蒼白,心臟跳動(dòng)減弱表明AMI誘導(dǎo)成功。

1.5 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)心肌組織中TREM2和CyclinA2 mRNA表達(dá)水平 使用Trizol試劑從心臟組織中分離總RNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。內(nèi)參為β-actin。采用2-△△Ct法對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算。引物序列為T(mén)REM2(正向引物:CTACCAGTGTCAGAGTCTCCGA,反向引物:CCTCGAAACTCGATGACTCCTC)、CyclinA2(正向引物:TTGTAGGCACGGCTGCTATGCT,反向引物:GGTGCTCCATTCTCAGAACCTG)和β-actin(正向引物:AGAGGGAAATCGTGCGTGAC,反向引物:AGGAAG-AGGATGCGGCAGT)。

1.5.2 免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)心肌組織中蛋白表達(dá) 用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液提取心肌組織總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)總濃度后,將蛋白質(zhì)(30 μg)變性并通過(guò)15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉膜1 h,TBST洗膜3次(每次10 min)后。將膜與β-actin一抗以1∶1 000稀釋后在4℃下孵育過(guò)夜(12～16 h),然后將HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶40 000)與膜在常溫孵育1 h。將膜與CyclinA2一抗以1∶400稀釋后在4℃下孵育過(guò)夜,然后將HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(1∶40 000)與膜在常溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影后用Tanon 5200發(fā)光成像系統(tǒng)捕獲圖像,用Image J軟件計(jì)算條帶灰度值。

1.5.3 HE染色和Masson染色檢測(cè) 心肌組織病理學(xué)變化腹腔注射過(guò)量戊巴比妥(130 mg/kg)后斷頸處死,生理鹽水灌流后,取結(jié)扎線下方的左心室組織。4%多聚甲醛固定48 h后,經(jīng)梯度脫水后石蠟包埋和切片(厚度5 μm)。切片在60℃烘箱中烤片2 h,冷卻至室溫后進(jìn)行常規(guī)HE染色和Masson染色。用光學(xué)顯微鏡觀察組織損傷,Image J計(jì)算心肌病變程度和纖維化面積。

2 結(jié)果

2.1 冠心病患者血漿中TREM2濃度升高 冠心病患者的血漿TREM2水平高于健康對(duì)照組,兩組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.592,P=0.020)(圖1)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05。

2.2 PCR結(jié)果證明梗死后第2天心肌中CyclinA2表達(dá)最高 RT-PCR結(jié)果顯示,MI后1、2、3 d,心肌組織中的TREM2 mRNA表達(dá)逐漸增加(P<0.05)(圖2A),CyclinA2在梗死后第2天mRNA表達(dá)量達(dá)到高峰(P<0.05)(圖2B)。

A.心肌組織中的TREM2 mRNA表達(dá)隨時(shí)間變化情況;B.心肌組織中的CyclinA2表達(dá)隨時(shí)間變化情況。與對(duì)照組比較,***P<0.001;與1 d比較,###P<0.001;與2 d比較,△P<0.05。n=6,FA=81.350,PA<0.001;FB=46.650,PB<0.001。

2.3 心肌組織CyclinA2蛋白表達(dá)水平 Western blot對(duì)各組小鼠心肌組織中CyclinA2蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。分為對(duì)照組、假手術(shù)組、C57和TREM2-/-小鼠MI后第2天梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)。如圖3所示,與對(duì)照組相比,C57小鼠梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)心肌中CyclinA2蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。TREM2-/-梗死區(qū)心肌中CyclinA2蛋白表達(dá)水平較C57梗死區(qū)減少(P<0.05),此外TREM2-/-梗死邊緣區(qū)心肌中CyclinA2蛋白表達(dá)水平較C57梗死邊緣區(qū)減少(P<0.05)。

2.4 各組小鼠心肌組織損傷比較 HE染色結(jié)果顯示(圖4),對(duì)照組和假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,心肌纖維排列整齊,無(wú)明顯水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與對(duì)照組相比,C57和TREM2-/-MI組小鼠心臟中可見(jiàn)心肌細(xì)胞排列紊亂、腫脹、數(shù)量減少,心肌纖維出現(xiàn)斷裂,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯(C57MI:P=0.044;TREM2-/-MI:P=0.000);與C57組相比,TREM2-/-小鼠心臟心肌細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量減少,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加,心肌損傷加重(t=4.781,P=0.001)。病理評(píng)分根據(jù)半定量量表分級(jí):0=無(wú)病變;1=涉及25%心肌的病變;2=累及25%～50%心肌的病變;3=累及50%～75%心肌的病變;4=累及75%～100%心肌的病變[9]。Image J計(jì)算各組心肌病變程度得到相應(yīng)的評(píng)分。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,***P<0.001;與C57MI組比較,##P<0.01。n=6,比例尺:50 μm;H=22.181,P<0.01。

2.5 Masson染色顯示各組小鼠梗死邊緣區(qū)心肌纖維化程度 Masson染色顯示(圖5),假手術(shù)組膠原纖維網(wǎng)保持完好,規(guī)律地排列在心肌細(xì)胞之間;MI組在梗死邊緣區(qū)可見(jiàn)大量心肌細(xì)胞壞死并被膠原纖維替代,心肌纖維化明顯(P<0.001),殘留的心肌細(xì)胞數(shù)目少且排列紊亂;TREM2-/-MI組心臟梗死邊緣區(qū)膠原纖維較C57MI組明顯增多(P<0.001),纖維化程度加重。

與假手術(shù)組比較,***P<0.001;與C57MI組比較,###P<0.001。n=6,比例尺:100 μm;F=165.300,P<0.001。

3 討論

MI后大量心肌細(xì)胞凋亡引起的心力衰竭是MI后主要的并發(fā)癥。目前很多研究表明干細(xì)胞療法[10]和外泌體療法[11-12]可能是心臟修復(fù)和再生的新方法。有大量研究表明向梗死心肌輸送干細(xì)胞可以促進(jìn)心臟修復(fù),預(yù)防或逆轉(zhuǎn)心室重塑[13]。外泌體療法作為一種無(wú)細(xì)胞療法減少了干細(xì)胞療法中輸入不良細(xì)胞的可能性,但是干細(xì)胞療法和外泌體療法的確切療效還有待于進(jìn)一步證實(shí),目前尚無(wú)法運(yùn)用于臨床。

既往研究提示TREM2在循環(huán)系統(tǒng)中可以發(fā)揮多種保護(hù)作用。動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)TREM2可以減輕高血壓小鼠的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡[14]。此外,心臟中存在一類(lèi)高表達(dá)TREM2的巨噬細(xì)胞亞群,可以識(shí)別并吞噬損傷的線粒體,在維持心臟代謝平衡中起到了重要的作用[15]。本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)心臟高表達(dá)TREM2的小鼠MI后心肌細(xì)胞存活率升高,梗死面積減小。提示TREM2可通過(guò)不依賴(lài)巨噬細(xì)胞的途徑直接增強(qiáng)缺血性損傷時(shí)心肌細(xì)胞的抗凋亡能力[5]。本研究發(fā)現(xiàn),MI患者TREM2血漿濃度較健康對(duì)照組顯著增加。野生型小鼠MI后心臟中TREM2和CyclinA2 mRNA表達(dá)水平增加,TREM2在MI后1、2、3 d逐漸增加,而CyclinA2在MI后第2天心臟表達(dá)達(dá)到高峰。可能的原因是凋亡心肌細(xì)胞來(lái)源的TREM2可以促使梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞表達(dá)CyclinA2。

CyclinA2在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著重要的作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并且促進(jìn)成年心肌細(xì)胞增殖和心肌再生[16]。原代大鼠心肌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染CyclinA2基因后,心肌細(xì)胞有絲分裂指數(shù)明顯升高,且多數(shù)細(xì)胞形成雙核[17]。本研究發(fā)現(xiàn)TREM2基因敲除后梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)CyclinA2的蛋白表達(dá)水平明顯減少,梗死區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加,梗死邊緣區(qū)膠原纖維含量顯著增加,纖維化程度增加。這進(jìn)一步表明了TREM2可能通過(guò)激活心肌細(xì)胞CyclinA2的表達(dá),在MI后通過(guò)增加心肌細(xì)胞再生發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

本研究表明,MI后盡管梗死區(qū)出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞死亡,但是心臟啟動(dòng)自我修復(fù)機(jī)制,通過(guò)TREM2激活梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞CyclinA2的表達(dá),促進(jìn)梗死邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。本研究的發(fā)現(xiàn)有利于進(jìn)一步闡明TREM2作為一種保護(hù)性因子參與MI后心臟修復(fù)的分子機(jī)制。但是TREM2引起激活心肌細(xì)胞CyclinA2表達(dá)增加的具體機(jī)制有待深入研究。