甲烷菌甲基輔酶M還原酶非組分蛋白McrD性質初探

高 鳳，言 行，王士巖，王殿龍，譚中標，時 號

（淮陰工學院 生命科學與食品工程學院,江蘇 淮安 223003）

沼氣的成分主要是甲烷（50%～75%）和二氧化碳（25%～50%）,在一定的溫度、濕度和厭氧條件下,經甲烷菌等厭氧微生物的協同發酵,可以通過畜禽糞便、秸稈和有機廢物等產生［1］。沼氣既可作為天然氣的替代和用于發電,又可作為車用燃料,是一種可再生的清潔能源［2］。此外,沼氣是以有機廢棄物進行發酵,原料和生產過程均對環境友好［3］,同時生產的有機肥料還能降低生產成本［4］,因此具有多種環境效益。提高沼氣產量的關鍵因素在于控制沼氣生產的原料和影響因素,高產沼氣需要豐富的有機物及適宜pH、溫度以及足量的菌種等［5-6］。Sygula等［7］用廚余垃圾作為原料厭氧發酵,沼氣產量達到了672 mL∕g-vs。Singkhala等［8］將棕櫚油廠廢水的pH調整為7.5,甲烷產量達到440 mL∕g-vs,是原始的2 倍。Liu 等［9］使用稻草作為底物研究不同溫度對甲烷的產量的研究,55 ℃消化的甲烷產量為133.3 L∕kg-vs,比35 ℃的甲烷產量高約20%。此外,使用工業和農業生產的廢水厭氧發酵生產沼氣仍是世界上最具經濟效益且正在使用的一種成熟工藝［10］。Allah 等［11］提出了一種牛糞與碾碎的玉米秸稈厭氧共消化的浮頂式沼氣池,甲烷的日產量和累積產量增加了40.3%和42.4%。傳統的甲烷升級方法是將二氧化碳去除來提高甲烷的純度,而通過生物甲基化可以將氫氣與二氧化碳進一步處理產生甲烷,因此不去除二氧化碳直接進行沼氣升級是一種更有效的沼氣利用方法。Stangeland 等［12］發現雙金屬Ni-Ru∕Al2O3在350 ℃時二氧化碳轉化率為82%,甲烷的選擇性為100%,添加少量的Ru 具有促進作用。Jonson［13］通過研究直接在滴流床系統中接種富含產氫產甲烷菌和生物膜固定化的方法,發現在高溫下甲烷的純度可以達到98%。

隨著生物技術和生物信息學的發展,研究人員逐步解析了甲烷的代謝通路,它是由產甲烷古菌通過代謝將乙酸、甲基化合物和CO2∕H2等轉化為甲烷［14］。甲烷的厭氧氧化在100 多年前首次發現［15］,截至目前,產甲烷有關的許多酶已被鑒定和進行了生理生化表征［16］。甲烷菌的甲基輔酶M還原酶（Methyl-coenzyme M reductase,MCR）分別催化了甲烷化的最后一步和甲烷厭氧氧化的第一步,是甲烷產生和氧化的關鍵酶［17］。mcr操縱子是由mcrA、mcrB、mcrC、mcrD、mcrG 五個基因組成的基因簇,產物MCR 是一種（αβγ）2多酶復合體,其催化中心含有鎳卟啉F430輔酶因子［18］。MCR的α-、β-和γ-亞基分別由mcrA、mcrB和mcrG基因編碼［19］,而mcrC和mcrD功能未知［20］。Prakash等［21］通過研究A3a 蛋白發現mcrC 基因產物可能在MCR 的激活中發揮作用。目前,科研人員推測mcrD基因產物有可能以類似于伴侶蛋白參與MCR組裝,或者可以直接或間接調節MCR 活性［22-23］。但是,McrD如何發揮作用,其作用機制有待解析。借助X 射線技術對McrD 與相關復合物的三維結構進行研究,有望解析McrD結構和功能［24］。但是,X射線技術獲取蛋白晶體結構的制約因子在于高質量的蛋白質晶體,只有獲得高質量蛋白質晶體才能得到理想的衍射數據,進而通過軟件解析蛋白結構和分析蛋白質功能。

本研究借助生物信息學相關知識,選擇了11個不同來源甲烷菌的mcrD 基因在E.coli BL21（DE3）中進行異源表達、純化并進行結晶,并通過生物信息學分析其潛在的關系和功能,旨在獲得McrD 的蛋白質晶體,為McrD 結構和功能的解析提供理論依據進而提高畜禽糞便、農林廢棄物、有機廢水等資源轉化制備甲烷的效率。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與培養基

借助NCBI網站確定需要研究的McrD蛋白質氨基酸序列,由金斯瑞生物科技有限公司合成且連接至pET-20b載體。E.coli BL21（DE3）、E.coli DH5α 感受態細胞均為實驗室保存。

Luria-Bertani（LB）液體培養基：氯化鈉10 g∕L,胰蛋白胨10 g∕L,酵母提取物5 g∕L。LB固體培養基：氯化鈉10 g∕L,胰蛋白胨10 g∕L,酵母提取物5 g∕L,瓊脂粉15 g∕L,滅菌后冷卻至50 ℃時加入氨芐青霉素,混勻后倒入培養皿于4 ℃冰箱保存。

1.2 實驗試劑

咪唑、過硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷、無水乙醇、鹽酸、冰醋酸、氯化鈉、氯化鎂、考馬斯亮藍R-250 均購自國藥集團。氨芐青霉素、二硫蘇糖醇、四甲基乙二胺、isopropylβ-D-thiogalactoside（IPTG）、硫代半乳糖苷、30%丙烯酰胺、dithiothreitol（DTT）、蛋白質濃度試劑盒購自生工生物工程上海有限公司。蛋白質晶體生長試劑盒：Index1-96、Crystal Screen（Ⅰ、Ⅱ）、PEG∕ION（Ⅰ、Ⅱ）均購自Hampton Research公司。

1.3 生物信息學分析

首先,借助XtalPred-RF 在線網站初步推測McrD 相關理化性質,進行初步篩選。然后使用SnapGene 軟件對氨基酸序列分析和比對,排除一些相似度過高的序列,篩選出11 個不同來源的McrD 蛋白質氨基酸序列（見表1）。通過MEGA7對11 種氨基酸序列進行比對和系統發育分析,并通過AlphaFold 2對McrD的結構進行同源建模。

表1 11個來源不同的McrD氨基酸序列號

1.4 McrD表達、純化和純度測定

將合成的11 種mcrD 基因重組載體轉化至E.coli BL21（DE3）感受態細胞,用氨芐青霉素篩選陽性轉化子,在含氨芐青霉素的液體LB中培養篩選出的陽性轉化子。將種子液轉至大錐形瓶培養4 h 后使用冰浴快速降溫至16 ℃,加入終濃度為0.1 mmol∕L 的IPTG 誘導培養16 h。因為McrD 來源于厭氧古細菌,為了防止氨基酸氧化,加入終濃度為1 mmol∕L的DTT維持還原性環境。培養結束后,取適量菌液,于4 ℃、5 000 r∕min 離心10 min,然后倒棄上清液,使用裂解緩沖液洗滌沉淀的菌體3次,然后將菌體重懸于裂解緩沖液中。接著冰浴超聲波225 W破碎40 min,超聲2 s間隔8 s。破碎后的溶液于4 ℃、10 000 r∕min離心40 min,緩慢倒出上清后使用鎳柱親和層析法進行純化。

通過鎳柱親和層析法得到的蛋白質,其純凈度達不到結晶所需的程度,需要進一步純化。選擇陰離子交換層析是因為在pH 7.4的緩沖液中等電點為5.4 的蛋白質表面帶負電荷［25］。為探究McrD蛋白質在天然狀態下的聚集情況,本研究通過Superdex 200 increase 10∕300 GL凝膠排阻色譜測定McrD實際分子量。最后,使用SDS-PAGE來鑒定McrD蛋白純度。

1.5 蛋白質結晶

本研究選用Pre-Crystallization Test試劑盒進行蛋白質濃度初步篩選。依次將200 μL蛋白質晶體生長試劑Index 1-96、Crystal Screen（Ⅰ、Ⅱ）、PEG∕ION（Ⅰ、Ⅱ）加入16孔結晶板內,然后取1 μL的蛋白質溶液與1 μL池液在蓋板上充分混合,在孔邊緣涂上真空硅脂,之后在結晶池上方放置倒扣的結晶板并檢查密封性。48 h后檢查晶體生長情況。若生長情況未達到預期目標,可以適當延長晶體培養時間。

2 結果與分析

2.1 11種來源的McrD蛋白質序列分析

如圖1 所示,McrDform與McrDcat隸屬于MCR I,McrDfor、McrDign和McrDthm隸 屬 于MCR II,McrDmar、McrDoki、McrDkep和McrDthe隸屬于MCR Ⅲ。其中,McrDthm與McrDkep和McrDthe雖為鄰近分支但屬于不同類型的同工酶,McrDhar與其他不同屬來源的蛋白質相比差異較大。圖2 為11 個McrD 蛋白質氨基酸序列對比圖,從圖2 中顏色深淺可以看出McrD蛋白保守程度比較高,只是在部分片段存在不同。

圖1 使用NJ法制作11個McrD蛋白質的系統進化樹

圖2 不同來源的11個McrD蛋白質氨基酸比對圖

2.2 McrD的氨基酸分布與二級結構

借助在線網站（https：∕∕www.expasy.org∕resources∕protparam）預測蛋白質的基本性質作為蛋白質提純過程的重要依據。以McrDign為例,圖3為在線網 站（https：∕∕www.novopro.cn∕tools∕secondary-structure-prediction.html）預測的蛋白質二級結構,McrDign蛋 白 質 由7 個Helix,11 個Strand 和18 個Coil 構成。與其他McrD 相比,雖然部分結構存在有所伸長或縮短的差異,但二級結構框架是相同的,其數量與組合方式也基本不變,再次證明McrD在進化上的保守性。

圖3 McrDign的二級結構示意圖

2.3 McrD的三維結構模擬

圖4為借助AlphaFold 2模擬的蛋白質三級結構示意圖,其中,圖4（A）為單體結構示意圖,圖4（B）為二聚體結構示意圖。從圖4（B）中可以看出McrDign的二聚體是由兩個單體互相交叉連接形成了一個形似瓶塞的結構,推測可能與McrD亞基功能相關［26］。

2.4 不同來源的11個McrD蛋白質的表達、純化與結晶

本研究對11個McrD蛋白進行表達,結果如圖5 所示,因McrDthe、McrDthm、McrDsmi蛋白形成包涵體,不論是優化表達條件還是優化密碼子都無法得到可溶性蛋白,所以在上清中幾乎不存在目的蛋白質,因此相應泳道幾乎沒有條帶。在對McrD蛋白質進行第二次純化時,選擇在洗脫曲線最高峰及兩側對稱區間的蛋白質溶液可以確保收集到的蛋白質的性質穩定且均一。分子篩測定分子量結果表明,McrDmar和McrDign蛋白質在天然狀態下均以二聚體形式存在。

圖5 McrD 蛋白質鎳柱純化SDS-PAGE電泳圖

由于McrDthm、McrDsmi和McrDthe蛋白質為包涵體,因此放棄對這3 個蛋白進行晶體培養,只對剩余8 個蛋白質進行初步結晶。蛋白質篩選的初篩結果與推薦操作具體見表2。最后獲得了McrDign、McrDform兩個蛋白質晶體（見圖6）,得到的兩個蛋白晶體主要為針狀以及少量片狀晶體,晶體培養條件需要進一步優化。

圖6 McrDign（A、B）與McrDform的晶體圖片（C）

表2 蛋白濃度篩選與推薦操作

2.5 McrD結晶條件優化

上述得到的晶體未能達到預期目標,因此選用PEG∕ION Screen 13、PEG∕ION Screen 7、PEG∕ION Screen 22、Index 38、Index 61 對上述McrDign進行進一步晶體培養條件優化,得到優化的培養條件為：27%PEG 3350、0.29 mol∕L CaCl2和4.4 mg∕mL初始蛋白質濃度。與圖6結果相比,蛋白質液滴內的沉淀變少,晶體質量明顯得到提升（圖7A）。

隨后,用4：1（v∕v）PEG∕ION Screen 7進行進一步優化,培養14 d后得到如圖7B的質量更好的片狀晶體,該片狀晶體已達到X 衍射所要求的質量標準。

3 討論

MCR 可分為MCR Ⅰ、MCR Ⅱ和MCR Ⅲ三類同工酶［18,27］,三者來自同一祖先,故整體結構高度相似,但蛋白質表面存在明顯的差異。部分產甲烷菌含有MCR Ⅰ和MCR Ⅱ兩種同工酶,如來源于M.formicicum Mb9的McrDfor和McrDform分別隸屬于MCR Ⅱ和MCR Ⅰ,其結構具有60%～70%的相似性［25］。 MCR I和MCR III大多含有mcrBDCGA 完整的基因簇,部分MCR II 在進化過程中丟失了mcrC 基因,可推測在進化過程中MCR I分化形成MCR III且部分MCR III在分化為MCR II進化過程中丟失了mcrC 基因,該推測與進化樹表觀一致。McrD在進化上高度保守,與Rospert等［28］發現McrD旁系同源基因保守的結果相符,推測McrD蛋白質具有重要的功能。此外,現有的研究表明因其所處的高度厭氧的生理環境使McrD 具備了較高的還原性［29］。Lyu 等［26］的研究表明MCR 各亞基是按一定順序進行組裝。在此基礎上,本研究認為McrD 的二聚體中的瓶塞結構可以防止McrA折疊并促進McrA、McrB和McrG結合,此功能與分子伴侶的性質相似。MCR作為（αβγ）2雜合六聚體蛋白復合物,含有兩個活性位點通道,每個活性位點都含有輔酶F430［30］。本研究推測McrD 二聚體可以與游離的F430暫時結合并將F430運輸至MCR中心位置,使F430嵌入通道底部。最后,McrD 脫離雜合六聚體蛋白復合物［31］。Sherf等［32］發現在Methanococcus vannielii 中的McrD 基因產物不存在基于酶活性純化的MCR 和通過天然凝膠電泳分離的MCR 全酶中,但沒有活性的MCR 存在McrD 的基因產物,這與Lyu等［27］推測McrD在參與MCR組裝完成后丟失的結論相符。本研究暫未獲得高質量的用于X衍射的蛋白質晶體,然而國際上目前還沒有該蛋白結構的任何相關報道。因此,本研究為獲得高質量McrD蛋白晶體以及McrD的結構和功能解析提供了重要的實踐基礎。

綜上所述,本研究通過生物學信息學分析McrD 序列,發現McrD 在進化過程中高度保守且具有重要功能,三維結構模型顯示McrD可能具有分子伴侶的功能。本研究異源表達了11個不同來源的表達McrD,得到其中8種可溶性重組蛋白,并用親和層析和陰離子交換柱進行了純化,結果表明McrD 天然狀態下以二聚體形式存在。McrDign和McrDfor兩種蛋白質結晶是通過晶體培養試劑盒優化培養條件后初步獲得的,經過進一步的條件優化后得到的McrDign蛋白質晶體達到了X晶體衍射所需,該研究成果為探索McrD的功能作用提供了重要的理論和實踐基礎。此外,本研究在提倡綠色低碳生產的大背景下對碳中和、節能減排等方面都具有重要現實意義。