miR-29家族對支氣管肺發育不良的影響研究進展

張 珂 汪凌燕 仇鵬業 饒興愉

1 贛南醫學院第一臨床醫學院2021級碩士研究生,江西省贛州市 341000; 2 贛南醫學院第一附屬醫院兒童醫學中心

支氣管肺發育不良(Bronchopulmonary dysplasia, BPD)是新生兒尤其是早產兒在基因易感性的基礎上,受宮內和出生后的多重打擊(包括炎癥、感染、機械通氣、高氧等)引起促炎、抗炎因子的級聯反應,對發育不成熟的肺引起損傷以及損傷后的異常修復,是早產兒的一種嚴重而長期的并發癥。其次,可靠的生物標記物能在疾病初始階段被檢測到,利用其早期識別患BPD風險較大的嬰兒,就可以避免或最小化疾病的有害影響。當前,盡管一些藥物治療方案可以改善BPD患兒的狀況,但仍沒有針對BPD的特異性治療方法。miR-29家族是微小RNA(MicroRNA)的成員之一,通過調節在各種生物過程(如增殖、存活、凋亡和血管生成)中發揮作用的靶基因,而在疾病中發揮重要作用,已知miR-29家族是許多癌癥診斷和預后的臨床標志物,可以作為治療癌癥的潛在靶點[1]。這表明,通過miR-29家族識別有BPD風險的嬰兒有助于提出針對性的治療策略。現對miR-29家族參與BPD發生機制的研究進展進行綜述。

1 miR-29家族在肺泡的產生、成熟和細胞外基質(ECM)重塑等肺發育過程中的作用

1.1 miR-29家族與肺泡發育 肺泡化是形成肺泡(肺的主要氣體交換單位)的過程,是晚期肺發育的目標。在早期肺發育過程中形成的末端空域被次級分隔的過程分隔開來,逐漸產生數量越來越多的較小直徑的肺泡,這大大增加了進行氣體交換的面積。肺泡化的障礙發生在BPD中,并可能因對肺血管的擾動導致肺動脈高壓而變得復雜[2]。在新生小鼠中,長期高氧可誘發肺泡發育停滯,將新生小鼠暴露于80%O2或室內空氣(RA)14d或29d后,高氧小鼠的肺部顯示出與BPD一致的組織學變化;對這些小鼠肺組織進行全面的miRNA和mRNA分析,鑒定出許多動態調節的miRNA和相關mRNA靶基因;miR-29在高氧小鼠的肺部顯著增加,通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白質印跡和免疫組織化學驗證了miR-29的幾個預測的mRNA靶標,在體外也驗證了miR-29的靶標[3]。另有研究用高氧誘導模擬BPD小鼠模型,建立高氧誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞(MLE-12)作為細胞模型,qRT-PCR用于確定lncRNA牛磺酸上調基因1(TUG1)、miR-29a-3p和彈性蛋白(ELN)的相對表達;與未發生BPD的肺組織相比,BPD小鼠肺組織中miR-29a-3p上調,TUG1和ELN下調;而TUG1可以減輕BPD小鼠的肺損傷并促進高氧誘導的MLE-12細胞的增殖,也會抑制高氧誘導的MLE-12細胞的炎癥反應和細胞凋亡;TUG1負調控并靶向miR-29a-3p,miR-29a-3p反向調控ELN,即通過降低高氧誘導的MLE-12細胞中的ELN或增加miR-29a-3p,可逆轉TUG1對細胞凋亡和炎癥的抑制作用;TUG1通過調節miR-29a-3p/ELN軸減輕BPD小鼠的肺損傷,起到了預防或改善BPD的作用[4]。上述分析表明miR-29a在改善高氧誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞中起著重要的作用。

肺泡Ⅱ型細胞能獨特地合成表面活性劑,表面活性劑是一種調節發育的脂蛋白,對肺發育至關重要;cAMP顯著誘導妊娠中期人胎肺(HFL)中表面活性蛋白A基因(SFTPA)的表達,而轉化生長因子β(TGF-β)和缺氧會抑制cAMP對SP-A表達的誘導;研究中培養的HFL上皮細胞中的miR-29表達促進cAMP增加并受到缺氧抑制,而miR-29靶標TGF-β2則被協調降低;同時在培養的HFLⅡ型細胞中對miR-29家族的敲低阻斷了cAMP誘導的SP-A表達和含表面活性劑的層狀體的積累,表明其生理相關性,而且過程中涉及TGF-β信號傳導的抑制;此外,cAMP增加了內源性甲狀腺轉錄因子1(TTF-1/Nkx2.1)與HFLⅡ型細胞中miR-29ab1啟動子的結合,并且TTF-1增加了miR-29ab1啟動子驅動的熒光素酶在共轉染試驗中的活性;該研究將miR-29家族成員確定為TTF-1驅動SP-A表達和肺泡Ⅱ型上皮細胞分化的介質[5]。值得注意的是,反復滴注表面活性劑和使用表面活性劑作為布地奈德的載體是減輕慢性肺病負擔的有希望的策略,正在進行的表面活性劑或干細胞治療研究可能有助于改善早產兒的呼吸預后[6]。

BPD是一種慢性肺部疾病,是早產兒嚴重且遠期的并發癥之一,因早產兒肺發育尚不成熟,在未使用肺泡表面活性物質的情況下使用呼吸機,易出現BPD,主要表現為持續低氧血癥,將引起小兒生長發育落后。上述研究表明miR-29的動態調控在BPD異常肺發育的病理生理學中起著重要作用,BPD的發生與肺泡Ⅱ型上皮細胞的增殖、分化、凋亡密切相關。miR-29家族在改善肺泡Ⅱ型上皮細胞中的作用以及與表面活性劑的生理相關性表明其可能在肺泡化過程中具有重要意義。

1.2 miR-29家族與ECM重塑 細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)是由細胞分泌到細胞外間質中的大分子物質構成的復雜網架結構,支持調節組織發生并影響細胞的生物學過程。肺部ECM結構即肺部發育過程中的彈性蛋白和膠原蛋白網絡組織,膠原沉積失調和彈性蛋白纖維組織紊亂是臨床和實驗性BPD的病理標志[7]。miR-29家族和ECM重塑有潛在聯系。研究發現miR-29a參與ECM蛋白質的調節[8],ECM重塑在BPD中的作用也表明miR-29a可能通過調節ECM重塑影響BPD的發生。目前對于miR-29a相關靶基因也有部分研究,GAB1是miR-29a的直接靶基因,已證實miR-29a的下調可以提高GAB1的表達,減少細胞凋亡并刺激增殖,最終阻礙BPD的發展[9]。由此可知miR-29a具有作為預防BPD的新靶標的潛力。

miR-29b靶向廣泛的ECM基因,抑制作用主要是中等的。有研究使用膠原蛋白1a1(Col1a1)啟動子構建了新型Col1a1-miR-29b載體,該啟動子可表達miR-29b-3p,使膠原蛋白合成增加達到膠原蛋白之間的動態平衡;結果表明Col1a1-miR-29b載體可作為膠原蛋白和其他ECM蛋白表達的動態調節劑,潛在地減少過量miR-29b水平產生的副作用[10]。這表明miR-29b可作為潛在且有效的ECM蛋白調節劑。在診斷為BPD的患者中,一部分嬰兒發展為重度BPD并伴有不成比例的肺部疾病,因ECM的增加或失調而出現阻塞性和/或限制性肺功能障礙;將懷孕的C3H/HeN小鼠在胚胎第16天接受腹膜內LPS注射,從出生到出生的14d,新生幼鼠都暴露于85%的氧氣,出生后第3天,通過鼻腔給藥AAV9-miR-29b或AAV9-對照,分析小鼠肺組織中miR-29表達、肺泡形成、基質蛋白水平和定位的變化;表明盡管在出生后第28天在AAV9-miR-29b治療的小鼠中僅檢測到肺泡化的適度改善,但治療完全減弱了基質蛋白表達和定位的缺陷;證實了AAV9介導的miR-29b在肺發育過程中的過表達將改善肺泡化并最小化基質沉積的有害影響,上述分析表明 miR-29b的過表達可作為治療或預防早產兒嚴重BPD的新策略[11]。

轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員是BPD進展過程中的關鍵調節因子。在室內空氣或85%O2中培養小鼠肺上皮細胞(MLE-12細胞)和小鼠胚胎成纖維細胞(NIH/3T3細胞),然后予以LXA4、抗TGF-β抗體和let-7c模擬/抗-microRNA轉染,結果表明高氧治療顯著改變了α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、彈性蛋白、膠原蛋白Ⅰ和基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)等幾種重要的ECM蛋白表達,而且用5S,6R-甲基-LXA4和抗TGF-β抗體處理均可減弱高氧誘導的小鼠肺泡化,并抑制高氧暴露的肺中TGF-β1和TGF-βR1的mRNA和蛋白質表達,但沒有抑制TGF-βR2的表達,此外,研究發現LXA4對高氧誘導的肺損傷的保護作用是通過let-7c的上調和TGF-β1的抑制以及隨后該信號通路的下調來介導[12]。

目前BPD的部分治療方法也不同程度基于ECM重塑[13],并且TGF-β信號通路和ECM蛋白表達存在聯系,然而,miR-29家族與BPD基質蛋白表達及定位相關的確切分子機制尚不清楚,仍需進一步研究以建立miR-29與TGF-β通路在BPD中的潛在聯系。

1.3 miR-29家族與肺纖維化 BPD是一種慢性衰弱性疾病,由于其頑固性的短期和長期并發癥,對早產兒的身心健康造成嚴重影響。氧化應激是引發該病的最主要原因之一,高氧會激活一系列危險事件,包括線粒體功能障礙、不受控制的炎癥、自噬減少、細胞凋亡增加和誘導纖維化[14]。在BPD中,由于肺發育的脆弱囊泡或肺泡早期階段遭受的環境損傷導致肺泡形成停止、周圍肺泡間充質纖維化。BPD組織病理學顯示肺泡減少和成纖維細胞增殖及分化為成肌纖維細胞表型,有研究發現Notch通路可能作為BPD病理生理的主要驅動,對因BPD死亡的患兒肺組織尸檢分析發現該通路在肺泡隔的纖維化區域內可能被激活[15]。這些相關研究都表明纖維化仍然是BPD的重要特征。已知組織纖維化是與器官功能障礙和衰竭相關的重要健康問題,而miR-29家族已被證明是抗纖維化microRNA,在多種纖維化器官和組織中下調,miR-29模擬物可預防小鼠模型中的肺纖維化[16]。研究發現有藥物通過miR-29b調節肺組織氧化應激和TGF-β1/Smad3信號通路降低肺纖維化程度[17]。多項研究顯示miR-29c的靶標ECM基因的表達模式與miR-29c表達相關,miR-29c 模擬物的引入消除了TGF-β 誘導的Fas抑制和細胞凋亡抵抗表型[18]。TGF-β信號傳導的變化與暴露于高氧引起的相似,在內源性miR-29敲低的人胎兒肺成纖維細胞中,miR-29被TGF-β1抑制,值得注意的是許多由TGF-β1上調的纖維化相關基因被miR-29敲低抑制。將TGF-β1和miR-29靶標進行比較后發現,miR-29控制著纖維化相關基因的另一亞群,包括層粘連蛋白和整合素,這表明miR-29在肺纖維化發病機理中的作用;此外,正常肺分析表明,在肺泡壁、胸膜間質細胞以及肺泡導管入口處的肺纖維化部位能檢測到miR-29,miR-29水平與纖維化的相關基因表達水平及其嚴重程度成反比[19]。BPD的發生發展過程有纖維化的特征,上述研究表明miR-29家族可以防止各種器官中的膠原過度表達,特別是成纖維細胞涉及的方面,從這個角度或許可以進行有關BPD纖維化特征的研究。miR-29的候選直接靶標富含編碼ECM成分的轉錄本[20],膠原蛋白和ECM蛋白在組織區域的沉積增加是組織纖維化的主要過程,目前的研究也表明miR-29家族可能作為治療BPD纖維化策略的重要組成部分,而TGF-β信號通路控制著纖維化相關基因的表達,miR-29的靶基因表達也參與纖維化過程,這進一步支持了BPD纖維化過程中二者間可能的聯系及潛在的機制。

1.4 miR-29家族與DNA甲基化 表觀遺傳機制包括DNA甲基化、RNA干擾、組蛋白修飾和染色質重塑等,僅改變遺傳表型而不改變DNA序列的變化。遺傳變化導致的異常表型難以逆轉,但若了解表觀遺傳學機制,專門開發針對靶向基因調控的藥物,將表觀遺傳工具用于臨床疾病的預防、診斷和治療,是易于接受且防治有效的新方法。研究發現miR-29a在甲基轉移酶信號傳導和表觀遺傳程序中的調控作用[21]。肺是高度復雜、結構精細的器官,具備正常生理功能所需的多種特殊細胞類型,其基因調控非常復雜,涉及多種遺傳和表觀遺傳因素,表觀遺傳調控受到氧化應激、感染和衰老等多種刺激的影響,因此其在特發性重塑疾病如特發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、BPD和肺動脈高壓(PH)中至關重要[22]。活性氧(ROS)的產生構成了肺部炎癥、細胞死亡、基因表達改變和血管收縮的初始驅動,導致肺部發育不良[23]。孕產婦炎癥和新生兒高氧血癥也會導致表觀遺傳改變,影響基因表達和BPD的發生[24]。將新生小鼠幼崽從出生開始就立即處于高氧狀態,并在85%O2水平保持14d,然后在室內空氣中保持14d后將小鼠肺組織用于RNA和DNA提取,隨后進行基于微陣列的肺轉錄組評估和補充甲基化組分析以研究高氧后與免疫系統相關的基因表達與表觀基因組(DNA甲基化)之間的調節關系;觀察到小鼠肺高氧后,免疫系統中大量相關基因表現出顯著的表達改變,PI3K-AKT通路和免疫系統相關基因中存在顯著的DNA甲基化,推測氧損傷導致的基因失調可能是BPD早產兒對呼吸道感染的易感性增加和異常反應的部分原因[25]。研究證實表觀遺傳調控例如組蛋白修飾與氧化應激以及妊娠并發癥(例如PE)有關,而且敲低miR-29b會顯著改變DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、SIRT1和SIRT3的基因和蛋白質表達以及ROS產生、全基因組DNA甲基化和蛋白質乙酰化[26]。對暴露小鼠模型的表觀遺傳變化探究,證實恢復miR-29b表達會恢復組蛋白甲基化標記,而組蛋白修飾H3K4me3、H3K27me3、H3K36me2、H3K79me2和H4K20me3的表達降低,值得注意的是與H4K20me3相關的一種甲基化酶SUV40H2的表達下降,但需進一步的研究來確定整體組蛋白甲基化減少的原因和潛在的治療機會[24]。上述分析表明miR-29b與DNA甲基化的相互關系。肺組織在發育過程中所需超出基因組范圍信息的調控,也是其正常生理功能所必需的。表觀遺傳學機制包括DNA堿基修飾(如甲基化和脫甲基化等)、染色質蛋白修飾和非編碼RNA調控等的進一步研究將加速對BPD的理解,并尋找到許多新的治療靶點。

2 miR-29家族與BPD的預后

BPD可能是早產兒最具破壞性的疾病之一,其長期后果涉及多個器官系統,包括對肺功能和神經發育結局的不利影響[27]。重度BPD患者肺功能異常可持續至成人期,同時伴有運動耐量降低等,也會導致中樞神經系統發育受損,高氧下調了參與神經元發育和成熟的基因[28]。在研究設計的Morris迷宮實驗中,BPD模型大鼠表現出更多的海馬凋亡細胞、更長的逃逸潛伏期,進一步檢測發現BPD通過HIF-1α誘導提高p53水平,此外, HIF-1α和p53抑制劑均抑制海馬半胱天冬酶-3;但BPD新生兒通過p53和HIF-1α引起海馬認知功能受損和神經元凋亡的確切機制有待進一步研究[29]。通過對miRNA在深低溫停循環引起神經元死亡的發病機制中具體作用的研究,發現miR-29通過靶向促凋亡的BCL2家族成員PUMA,可能出現針對DHCA介導的神經細胞損傷的保護策略[30]。miR-29b在發育過程中的時間表達模式也與其在神經元存活中的保護作用相關,使用嗜神經肽將特異性抗miRNA遞送到小鼠大腦,發現在miRNA敲低之后,miR-29的一個靶標電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)在小鼠的海馬、小腦及皮層的表達增加了幾倍,而且下調miR-29敲低細胞中的VDAC1實現部分細胞凋亡,表明miR-29調節VDAC1表達是大腦中神經元細胞存活的重要因素[31]。也有研究證明miR-29在星形膠質細胞中高表達及靶向促凋亡的BCL2家族成員能保護神經元細胞[32]。通過研究miR-29在體外和體內對海馬神經元的作用也發現miR-29c的上調部分地促進了SAMP8小鼠的學習和記憶行為[33]。綜上所述,miR-29家族參與神經元發育、存活及凋亡的過程。

BPD是一種慢性肺病,雖然總體發病率沒有變化,但醫療技術的進步使死亡率降低,同時BPD的長期影響也變得越來越明顯,除了會導致對肺部感染的易感性增加、運動耐力受損和肺動脈高壓,還會造成神經系統的不良結局,包括腦癱、發育遲緩風險增加、智商(IQ)評分降低、認知功能障礙等。此外,BPD幸存者的衛生保健使用率較高,從最初的住院治療開始,到繼續進行治療和專科隨訪,以及持續到成年期的身體和心理生活質量受損。因此迫切需要更好地了解miR-29家族在BPD的病理生理中的作用,以便對BPD患者進行長期評估和管理[34]。

3 miR-29家族的臨床研究及展望

臨床醫生在新生兒重癥監護病房使用多種療法來預防和管理BPD,BPD患兒的門診管理也是復雜的,需要兒科專家和治療師的協調。然而,目前大多數用于預防和管理BPD的療法都缺乏可靠的證據來支持其有效性,因此需要進一步開發有效的防治方法改善BPD的發生率。本文綜述了miR-29家族在BPD發病機制中的作用以及未來BPD研究直接或間接靶向miR-29家族的可能性。肺和心血管系統的發育與胎兒期及產后生活緊密交織在一起,產前產后多種因素都可能導致肺泡和血管形成異常,從而增加早產兒對BPD的易感性,正確認識肺泡簡化表型產生的機制有助于早期干預疾病的發生。BPD中ECM沉積的特征在于膠原蛋白以及成纖維細胞水平的升高,發現miR-29家族和ECM之間信號傳導路徑或許可成為BPD研究的一個新方向。目前已發現miR-29家族作為分子預后標記物的價值,表觀遺傳學的新工具也進一步促進了BPD組學方面的發展。近年來miR-29家族在防治BPD方面受到越來越多學者關注,對BPD的認識正在提高,但尚未轉化為全面的預防和臨床管理策略。本文綜述了miR-29家族對BPD發生發展的影響以及可能的研究方向,miR-29家族有廣泛的靶基因,在疾病的調控中十分復雜,但其作為可能的預測BPD的標志物在臨床還未應用,具體機制需在后續的基礎和臨床研究中進一步明確。