不同復溫時點的熱打擊人骨骼肌細胞損傷情況觀察及其機制

劉斌，袁芳芳，豆春麗，肖寶，李霖，李慧，蘇磊

1 中南大學湘雅醫學院附屬長沙醫院 長沙市第一醫院急診科，長沙 410005；2 南部戰區總醫院重癥醫學科；3 中南大學湘雅三醫院血液科

中暑是一種嚴重威脅軍民生命的急危重病，尤其是重癥中暑，常合并多器官功能衰竭綜合征［1-3］。橫紋肌溶解癥（RM）是重癥中暑的常見并發癥，目前多采用熱打擊人骨骼肌細胞（HSKMC）的方法模擬RM［4］。瞬時感受器電位香草酸受體亞型（TRPV）通道是TRP 通道家族的一個亞型，又被稱為辣椒素受體，是目前研究最多的TRP 通道蛋白。TRPV 包括6 個亞型，其中TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4 均有明顯的熱敏感性，被稱作溫度敏感通道，對Ca2+具有通透性，其活化后介導Ca2+內流［5-6］。本課題組前期研究發現，熱打擊可誘導HSKMC 細胞質游離Ca2+濃度升高、線粒體損傷及炎癥因子釋放增加，從而造成細胞損傷，但是復溫后的熱打擊細胞是否恢復還是損傷加重尚不清楚［7］。2019年3月—2020年5月，本研究觀察了不同復溫時點的熱打擊HSKMC 損傷情況，并探討其機制是否與TRPV4 及其介導的Ca2+內流有關。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：HSKMC 購自美國Santa 公司，用高糖DMEM 培養液（含10%胎牛血清、10 萬U/L 青霉素、100 mg/L鏈霉素），于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。主要試劑：CCK-8 檢測試劑盒、ECL 發光液、鈣離子熒光探針均購自上海碧云天生物技術有限公司，TRPV4 激動劑GSK1016790A（GSK）、TRPV4 抑制劑HC-067047（HC）均購自美國MCE 公司，TRPV4 抗體購自美國Abcam 公司，逆轉錄試劑盒、轉錄試劑盒均購自日本TaKaRa 公司。儀器：細胞培養箱購自美國Thermo Fisher 公司，透射電子顯微鏡購自日本日立新公司，全自動酶標儀購自美國Biorad 公司，流式細胞儀購自美國BD 公司，熒光定量PCR儀購自美國凱杰公司。

1.2 熱打擊細胞模型建立及復溫處理 將對數生長期的HSKMC 分為熱打擊組和對照組。熱打擊組于43 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養2 h，建立熱打擊細胞模型，然后置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中復溫，復溫時間分別為0、6、12、24 h。對照組置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。

1.3 細胞活力檢測 采用CCK-8 法。將細胞以5 × 104/孔接種于96 孔板中，待貼壁穩定后參照“1.2”進行分組處理。按照CCK-8 試劑盒說明書操作，每孔加入CCK-8溶液10 μL，將培養板置于37 ℃孵箱內孵育2 h。使用酶標儀測定450 nm 處的光密度（OD）值，計算細胞存活率。

1.4 細胞超微結構觀察 取分組處理后的兩組細胞，2.5%戊二醛固定液固定，4 ℃孵育過夜，透射電鏡下觀察細胞超微結構。

1.5 細胞TRPV4 蛋白檢測 采用Western blotting法。取分組處理后的兩組細胞，使用含有蛋白酶抑制劑的磷酸酶裂解液進行裂解，提取總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒定量檢測蛋白總濃度。行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白轉移至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉1 h。洗膜后加入TRPV4 及內參GAPDH 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗3 次，5 min/次；加入二抗（稀釋比例均為1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，5 min/次。使用ECL 發光液顯色、曝光，計算TRPV4蛋白相對表達量。

1.6 細胞TRPV4 mRNA 檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取分組處理后的兩組細胞，使用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，超顯微分光光度計根據OD260/280測定RNA 濃度和純度，轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄生成cDNA，上PCR 儀進行檢測。TRPV4 引物序列：上游引物5'-ATCGTCTCAGCAGCCCTCTA-3'、下游引物5'-TCGGAAAAGGTCCTTGAAGA-3'、引物長度168 bp；內參GAPDH 引物序列：上游引物為5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'、下游引物為5'-TTCTAGACGGCAGGTCAGG-3'、引物長度201 bp。采用2-ΔΔCt法計算TRPV4 mRNA相對表達量。

1.7 TRPV4 對Ca2+內流的影響觀察 采用流式細胞術。將對數生長期的HSKMC分為四組，即HS組、GSK+HS 組、HC+HS 組和NC 組。HS 組、GSK+HS組、HC+HS組均參照1.2建立熱打擊細胞模型，復溫時間均為12 h，GSK+HS 組、HC+HS 組在熱打擊前0.5 h 分別給予GSK 500 nmol、HC 5 μmol；NC 組僅在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。去除各組細胞培養液，PBS 沖洗3 次。按照鈣離子熒光探針說明書加入Fluo-4 AM 工作液（2 μmol），37 ℃孵育60 min進行熒光探針裝載。PBS 沖洗3 次，上流式細胞儀檢測Fluo-4 熒光強度，以此表示細胞內Ca2+濃度，激發波長為488 nm、發射波長為520 nm。

1.8 統計學方法 采用SPSS13.0 統計軟件。計量資料采用S-W 正態性檢驗，呈正態分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞存活率比較 復溫0、6、12、24 h的熱打擊組與對照組細胞存活率分別為80.81% ±6.14%、73.19% ± 6.09%、61.41% ± 7.9%、40.33% ±2.08%、100.00%；與對照組比較，復溫0、6、12、24 h的熱打擊組細胞存活率均降低（P均＜0.05）；隨著復溫時間的延長，熱打擊組細胞存活率依次降低，兩兩比較P均＜0.05。

2.2 兩組細胞超微結構比較 與對照組比較，復溫0、6 h的熱打擊組細胞即可出現超微結構改變，主要表現為細胞腫脹、體積變大，細胞質空泡化，線粒體腫脹、脫顆粒、雙嵴消失，細胞核周間隙增寬，細胞核凝聚、固縮，部分包膜連續性中斷；復溫12、24 h的熱打擊組細胞出現核仁溶解消失，細胞核碎裂、染色質邊集，細胞質結構崩解、呈顆粒狀。見OSID碼圖1。

2.3 兩組細胞TRPV4 mRNA 及蛋白相對表達量比較 與對照組比較，復溫0、6、12、24 h的熱打擊組細胞TRPV4 mRNA 及蛋白相對表達量均升高（P均＜0.05）。復溫0、6、12 h 的熱打擊組細胞TRPV4 蛋白相對表達量依次升高（P均＜0.05），復溫12、24 h的熱打擊組細胞TRPV4 蛋白相對表達量比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。復溫0、6、12、24 h的熱打擊組細胞TRPV4 mRNA 依次升高，兩兩比較P均＜0.05。見表1及OSID碼圖2。

表1 兩組細胞TRPV4 mRNA及蛋白相對表達量比較（）

表1 兩組細胞TRPV4 mRNA及蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

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2.4 四組細胞內Ca2+濃度比較 NC 組、HC+HS 組、HS 組、GSK+HS 組細胞內Ca2+濃度分別為2.72 ±0.54、6.06 ± 0.70、11.94 ± 1.35、31.61 ± 1.73，組間兩兩比較P均＜0.05。

3 討論

中暑是在劇烈的體力活動或暴露在熱環境后發生的極端高溫（核心體溫 ＞ 40.5 ℃）。根據病因和易感人群，中暑可分為經典型中暑和勞累型中暑［1］。RM 是勞累型中暑的常見并發癥，防治RM 是改善重癥中暑患者多器官功能衰竭綜合征及預后的關鍵措施［8，10-12］。RM 發生時肌細胞被破壞，釋放細胞內毒素、自由基及炎癥介質等物質入血，進一步引起凝血功能紊亂、血管內皮損傷、酸堿失衡等，從而造成多器官功能衰竭，增加患者病死率。以往研究報道，RM 并發其他臟器功能損傷的發生率為51.0%，病死率高達32.0%［8］。急性腎功能衰竭和彌漫性血管內凝血是RM 晚期最嚴重的并發癥，15%～33%的RM 患者可能發生急性腎功能衰竭［8-9］。此外，約25%的RM 患者還可能合并肝功能異常。因此，針對RM 進行相關研究對于降低重癥中暑患者病死率具有重要意義。本研究結果顯示，復溫0、6、12、24 h的熱打擊組細胞存活率均低于對照組，且隨著復溫時間的延長，熱打擊組細胞存活率依次降低；超微結構觀察結果顯示，復溫0、6 h的熱打擊組細胞即可出現超微結構改變，而復溫12、24 h的熱打擊組細胞甚至出現核仁溶解消失，細胞核碎裂、染色質邊集，細胞質結構崩解、呈顆粒狀；這提示熱打擊會降低HSKMC 存活率，且會造成細胞結構破壞，復溫時間越長，上述變化越明顯。

目前，RM 引發肌細胞損傷的具體機制尚未明確，可能與下列因素有關：①三磷酸腺苷（ATP）耗竭：位于質膜（肌膜）上的離子通道（包括Na+/K+泵和Na+/Ca2+交換器）在正常情況下維持細胞內低Na+和Ca2+濃度，而在肌纖維內保持高K+濃度；肌肉去極化導致Ca2+從肌質網流入細胞質，引起肌肉細胞發生肌動蛋白—肌球蛋白交聯收縮，所有這些過程都依賴于ATP 提供能量。RM 發生時伴隨ATP 能量耗竭，肌酸磷酸水平下降，糖元儲存減少等代謝紊亂；當ATP 能量降低或ATP 消耗發生時，會導致細胞內電解質平衡的破壞，結果是細胞內過多的Na+和Ca2+流入，細胞內Na+增加會將水吸入細胞內，破壞細胞內空間的完整性；而細胞內Ca2+增加會導致持續的肌原纖維收縮，進一步耗盡ATP。②細胞內鈣超載：肌肉缺血損傷導致各種病理性變化，使Ca2+內流增多，細胞內鈣超載繼發細胞功能失調，磷酸化酶、蛋白酶、核酸酶被激活，細胞膜被降解，細胞呼吸被抑制，造成ATP 生成減少。酶的激活伴隨大量能量需求，從而加劇缺血細胞已經存在的能量危機，最終導致細胞死亡。但不管其機制如何，往往都是通過級聯效應，使細胞外的Ca2+進入到細胞內，從而導致鈣超載，細胞內鈣依賴性蛋白酶及磷脂酶被激活，肌動蛋白與肌球蛋白產生病理性交互作用，導致肌原纖維、細胞骨架及細胞膜蛋白破壞，引起肌肉破壞、肌纖維壞死及細胞內容物釋放到細胞外和血液中。各種損傷最終結合在一個共同的效應通路上，從而啟動RM的級聯反應［14］。

TRPV4 是一種非選擇性的Ca2+通道蛋白，能被機械刺激、熱和內源性花生四烯酸代謝物（環氧二十三烷酸）在內的多種物理化學刺激以及炎癥刺激激活［14-15］。目前研究顯示，TRPV4 在腸上皮細胞、腸巨噬細胞和腸神經元等細胞中高表達［16-17］。TRPV4 激活可引起腸膠質細胞外Ca2+內流，并促進ATP 釋放與炎癥因子表達［18］。本研究結果顯示，與對照組比較，復溫0、6、12、24 h 的熱打擊組細胞TRPV4 mRNA 及蛋白相對表達量均升高，且隨著復溫時間的延長，其升高更明顯；這提示熱打擊造成HSKMC損傷的機制與激活TRPV4 有關。本研究結果顯示，NC組、HC+HS組、HS組、GSK+HS組細胞內Ca2+濃度依次升高，提示TRPV4特異性抑制劑HC可降低Ca2+內流，TRPV4特異性激動劑GSK則促進Ca2+內流。

綜上所述，熱打擊會造成HSKMC 存活率降低及結構損傷，熱打擊后復溫時間越長對細胞的損傷越大，其機制可能與促進TRPV4 表達及其介導的Ca2+內流有關，為尋找預防與治療RM 提供了新的干預靶點。但是本研究僅初步探討了TRPV4 參與RM的可能機制，仍需進一步體內實驗進行驗證并深入探討其相關調控機制。