刺槐素對小鼠骨髓巨噬細胞AIM2炎癥小體活化的抑制作用

葉勒丹·馬漢，王兆霞，吳選霞，補娟

新疆維吾爾自治區人民醫院醫學研究與轉化中心，烏魯木齊 830001

炎癥小體是細胞內的一個關鍵多聚蛋白復合體，在免疫和炎癥調控中發揮著重要作用。黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）炎癥小體是由AIM2、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和pro-Caspase-1 組成的一種多聚蛋白復合物，其活化后可激活Caspase-1，促進白細胞介素（IL）-1β、IL-18 成熟與釋放，從而引起炎癥反應［1］。AIM2炎癥小體在多種炎癥疾病中扮演著重要角色，參與了動脈粥樣硬化、皮膚病、肝病和神經炎癥疾病等的發生發展，抑制AIM2炎癥小體活化可能是治療這些疾病的一種策略［2-3］。目前已經發現了一些對AIM2炎癥小體有抑制作用的藥物，包括RGFP966、穿心蓮內脂、果糖—精氨酸等［4］，然而關于靶向AIM2炎癥小體的抑制劑報道較少。刺槐素是一種天然的植物黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性，參與糖尿病、哮喘、缺血性腦卒中等炎癥相關疾病的治療［5-6］。本課題組前期研究發現，刺槐素可以通過抑制Caspase-1 介導的IL-1β 表達，從而降低NLRP3、NLRC4炎癥小體活化［7］。但是刺槐素對AIM2炎癥小體活化的具體影響目前尚不清楚。2022年1月—2023 年1 月，本研究選用脂多糖（LPS）和一種雙鏈DNA（dsDNA）模擬物poly（dA：dT）共同誘導小鼠骨髓巨噬細胞（BMDMs）中AIM2炎癥小體的激活，觀察刺槐素對AIM2炎癥小體活化的影響，為研究炎癥相關疾病的發病機制及治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：C57BL/6 小鼠10 只，體質量（20 ± 2）g，6～8 周齡，購自新疆醫科大學，動物許可證號：SCXK（新）2018-0002，在室溫20～25 ℃和相對濕度約55%的環境下適應性飼養一段時間。主要試劑：刺槐素、LPS 購自美國Sigma 公司，poly（dA：dT）購自美國InvivoGen 公司，Caspase-1 抗體、IL-1β抗體購自美國Abcam 公司，IL-1β、IL-18、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒購自杭州聯科生物有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自南京建成科技有限公司。主要儀器：熒光倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，多功能酶標儀購自美國Bio-Rad公司，化學發光成像儀系統購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.2 BMDMs 的分離和培養 將小鼠頸椎脫臼處死，取出股骨后，從兩端將其剪開，使用無菌注射器將細胞吹出。將細胞收集至無菌離心管中，1 500 r/min離心4 min，隨后棄掉上清液。加入紅細胞裂解液3～4 mL，將細胞重懸，靜置4 min。加入無菌PBS并混勻，1 500 r/min離心4 min。將細胞懸液加入含有10 ng/mL 粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）的DMEM 培養基中，用無菌技術將其吹勻。將細胞懸液轉移到培養瓶中，置于37 ℃細胞培養箱中進行培養。

1.3 細胞分組及LPS、poly（dA：dT）、刺槐素處理當BMDMs 融合至約80%時，分為對照組、LPS 組、LPS+poly（dA：dT）組和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組。對照組將BMDMs繼續在完全培養基中培養3 h；LPS組將BMDMs 在加入含50 ng/mL LPS 的完全培養基中培養3 h；LPS+ poly（dA：dT）組將BMDMs在加入含50 ng/mL LPS 的完全培養基中培養3 h，再加入poly（dA：dT） 10 μmol/L 作用0.5 h；LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組將BMDMs 在加入含50 ng/mL LPS 的完全培養基中培養3 h，然后加入刺槐素10 μmol/L 作用0.5 h，最后加入poly（dA：dT） 10 μmol/L作用0.5 h。

1.4 細胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 和上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白檢測 采用Western blotting法。細胞裂解液總蛋白提取：收集三組細胞至離心管中，加入含蛋白酶抑制劑和廣譜磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液100 μL，充分混勻，4 ℃放置60 min；4 ℃條件下12 000 r/min 離心15 min，收集上清液。細胞上清液蛋白提取：收集三組細胞樣本至離心管中，離心后取上清液轉移至新的離心管中，加入相同體積的甲醇和1/4體積的氯仿渦旋混勻，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min；將上層液體去掉，再加入等體積甲醇，混勻后4 ℃條件下12 000 r/min 離心5 min，盡可能棄盡上清，55 ℃金屬浴干燥5 min。使用BCA 法對上述收集的液體進行蛋白質定量，取30 μg 蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），將分離的蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。轉膜完成后，用5%脫脂奶粉封閉2 h。加入IL-1β、Caspase-1 和內參β-actin（稀釋比例分別為1∶ 500、1∶ 1 000、1∶ 1 000）一抗，4 ℃搖床孵育過夜；加入二抗（稀釋比例為1∶ 5 000），搖床孵育1 h。使用三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBST）洗滌膜10 min，更換洗滌液，重復此步驟3 次。加入增強化學發光劑（ECL），進行避光顯色和顯影。采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.5 細胞上清液IL-1β、IL-18、TNF-α 蛋白檢測采用ELISA法。各組分組處理24 h后收集細胞上清液，加入到ELISA 板的適當孔中，根據ELISA 試劑盒說明書操作。使用試劑盒提供的特異性抗體對IL-1β、IL-18、TNF-α進行捕獲，將其固定在板上。加入適當的酶標記二抗，添加底物，觀察顏色反應，并根據反應的光密度測定板上的吸光度。使用標準曲線確定IL-1β、IL-18 和TNF-α 水平，計算每個樣品的目標蛋白質濃度。

1.6 細胞毒性檢測 采用LDH 法。取各組細胞上清液，按照LDH 試劑盒說明書操作，使用450 nm波長進行測定，參照公式（OSID 碼圖1）計算細胞上清液LDH濃度，以此表示細胞毒性。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0 統計軟件。計量資料采用S-W 正態性檢驗，呈正態分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗或Games-Howell檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 和上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達量比較 各組細胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。與對照組、LPS 組比較，LPS+poly（dA：dT）組和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達量均升高，且LPS+poly（dA：dT）組升高更明顯（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β和上清液Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達量比較（）

表1 各組細胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β和上清液Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與LPS+poly（dA：dT）組比較，△P＜0.05。

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2.2 各組細胞上清液IL-1β、IL-18 和TNF-α 蛋白表達比較 見表2。

表2 各組細胞上清液IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達比較（pg/mL，）

表2 各組細胞上清液IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達比較（pg/mL，）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與LPS+poly（dA：dT）組比較，△P＜0.05。

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2.3 各組細胞上清液LDH 水平比較 對照組、LPS 組、LPS+poly（dA：dT）組和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組細胞上清液LDH 水平分別為（223.189 ±13.283）、（913.839 ± 16.213）、（1 598.824 ±270.241）、（1 496.732 ± 75.670）U/L；與對照組比較，LPS 組、LPS+poly（dA：dT）組和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組細胞上清液LDH 水平均升高，且LPS+poly（dA：dT）組和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組升高更明顯（P均＜0.05）。

3 討論

炎癥小體是先天性免疫系統的一部分，負責感知受損細胞中來自病原體的危險信號，這對于保護宿主免受環境威脅至關重要。AIM2 是一種能識別細胞質內DNA 的傳感器蛋白，由N 端PYD 域和C 端HIN 域組成，當dsDNA 與HIN 結合時，可通過PYD結合ASC募集pro-Caspase-1形成AIM2炎癥小體，產生活化后的Caspase-1 可導致炎癥因子IL-1β、IL-18的成熟與釋放，二者是炎癥反應的關鍵調控因子，參與引起炎癥反應［8］。此外，活化后的Caspase-1 還可通過裂解焦孔素D（GSDMD），直接介導細胞焦亡［9］。因此，Caspase-1 和IL-1β 通常是AIM2 炎癥小體活化的直接標志。

近年來，AIM2炎癥小體在疾病調控中的作用備受關注，而尋找能夠抑制AIM2 炎癥小體的藥物具有重要的臨床治療意義。目前，許多抑制AIM2 炎癥小體的藥物主要通過研究與AIM2 相關的疾病進行探索，如RGFP966 抑制劑可通過下調AIM2 炎癥小體表達來減輕缺血性腦損傷［10］；穿心蓮內酯通過抑制AIM2 炎癥小體激活和細胞焦亡，從而改善放射性肺損傷［11］；槲皮素通過下調AIM2 表達而抑制JAK2/STAT1 通路，從而減輕炎癥性皮膚病引發的炎癥反應［12］。在感染DNA 病毒或轉染DNA 類似物的情況下，細胞質中的dsDNA 能夠被AIM2 直接識別［4］。DNA 病毒（小鼠巨細胞病毒、痘苗病毒、人乳頭瘤病毒等）或某些細菌（科斯特菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等）均能激活AIM2 炎癥小體［13］。刺槐素作為一種天然化合物，已有研究證明其具有抗炎和抗氧化等多種生物活性［5，14］，但是其對AIM2 炎癥小體的影響鮮見報道。

研究顯示，LPS 預刺激巨噬細胞并轉染poly（dA：dT）可特異性活化AIM2 炎癥小體，是一種用于篩選靶向AIM2 炎癥小體抑制劑的經典方法［15-16］。在炎癥小體激活途徑中，炎癥小體成分的轉錄上調和pro-Caspase-1 的激活被認為是導致pro-IL-1β 成熟的上游信號。為了研究刺槐素對AIM2 炎癥小體活化的影響，本研究檢測了細胞裂解液中的pro-Caspase-1、pro-IL-1β 表達變化，以及上清液中成熟的Caspase-1 和IL-1β 表達變化。結果顯示，與對照組、LPS組比較，LPS+poly（dA：dT）組上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達量均升高，這表明LPS 和poly（dA：dT）共同刺激可以激活小鼠BMDMs 的AIM2 炎癥小體，導致Caspase-1 和IL-1β釋放，從而引發炎癥反應，與已有的研究結果一致［17-18］。本研究結果顯示，各組細胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義，與LPS+poly（dA：dT）組比較，LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達量均降低，說明刺槐素對AIM2炎癥小體的抑制作用并非通過改變炎癥小體成分轉錄水平，而是通過抑制Caspase-1 的活化來實現的，該結果與既往研究結果類似［19］。

此外，本研究進一步通過ELISA法檢測上清液中炎癥因子IL-1β、IL-18和TNF-α的表達，結果顯示poly（dA：dT）誘導后BMDMs中這三種炎癥因子表達均升高，經刺槐素處理后只有IL-1β 表達降低，IL-18 和TNF-α 表達無明顯改變。炎癥因子IL-1β、IL-18 和TNF-α的生成不僅可以由AIM2炎癥小體激活，還存在其他生成途徑，這表明刺槐素可能并非通過AIM2途徑調控IL-18和TNF-α的表達。細胞毒性的檢測是為了解不同處理條件對細胞的影響，LDH是一種存在于細胞質中的酶，只有當細胞膜受損時LDH才會被釋放至細胞外。本研究結果顯示，poly（dA：dT）誘導后BMDMs上清液LDH濃度升高，經刺槐素處理后LDH無明顯變化。前期本課題組發現，刺槐素可抑制NLRP3 炎癥小體活化后LDH 的釋放，但本研究顯示刺槐素對AIM2炎癥小體活化后LDH的釋放沒有顯著影響，具體原因還需要深入研究。

綜上所述，刺槐素對LPS 與poly（dA：dT）共誘導小鼠BMDMs 的AIM2 炎癥小體活化具有抑制作用，能夠減少細胞中Caspase-1、IL-1β 蛋白表達，從而減輕細胞炎癥反應。這些發現為刺槐素作為潛在的炎癥抑制劑提供了有力支持，為其在AIM2 炎癥小體相關疾病治療中的應用奠定了基礎。但是，刺槐素如何抑制AIM2 炎癥小體的活化及其具體的作用機制仍需進一步研究，這將成為我們未來研究的重點。