膽?zhàn)龇剿幰簩Υ笫笾鲃用}內(nèi)皮細胞脂質(zhì)泡沫化的抑制作用及其機制

宋曉龍，潘仁友，涂冬云，顧月星，宋峻，伍德明，倪其猛

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城中醫(yī)院 鹽城市中醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鹽城 224001

冠心病（CHD）最核心的發(fā)病機制就是動脈粥樣硬化（AS），本質(zhì)上是一種大、中動脈內(nèi)膜慢性持續(xù)進展的炎癥性血管病變［1-2］。在AS 早期即可出現(xiàn)內(nèi)皮細胞損傷，造成巨噬細胞在血管內(nèi)皮細胞聚集，低密度脂蛋白（LDL）開始沉積，內(nèi)皮細胞被氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）激活，吸引吞噬細胞向內(nèi)膜中積聚，大量釋放促炎細胞因子，導(dǎo)致更多炎癥細胞浸潤和平滑肌增生，從而加速AS 的啟動［3］。膽?zhàn)龇绞俏铱剖覉F隊基于胸痹心痛病的中醫(yī)理論研究所創(chuàng)立，由溫膽湯和丹參飲加減而成，具有健脾化痰降濁、益氣活血化瘀等功能，常用于治療冠心病心絞痛，臨床療效顯著［4］。2022 年8 月—2023 年5 月，本研究以O(shè)x-LDL 刺激大鼠主動脈內(nèi)皮細胞（RAECs）脂質(zhì)泡沫化模擬AS的內(nèi)皮細胞，探討膽?zhàn)龇剿幰簩?nèi)皮細胞脂質(zhì)泡沫化的抑制作用及其機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：RAECs 購自美國Cell 公司，使用含有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。膽?zhàn)龇剑旱?0 g、水蛭3 g、半夏12 g、竹茹12 g、陳皮6 g、黃芪20 g、茯苓10 g、檀香3 g、砂仁3 g、枳實12 g、桔梗6 g、炙甘草3 g；加入2 L 水浸泡1 h 后煎煮1 h，過濾后再加入2 L 水煎煮50 min，再次過濾；將兩次煎煮的濾液繼續(xù)煎煮濃縮至濃度2 g/mL的藥液。主要試劑：腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 檢測試劑盒及蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2（JAK2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、p-JAK2、p-STAT3 抗體均購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司，活性氧（ROS）檢測試劑盒購自中國北京百奧萊博科技有限公司，JAK2、STAT3 引物序列均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成。

1.2 Ox-LDL 作用濃度確定 選擇對數(shù)生長期的RAECs，以1 × 104/孔接種于96 孔板中，使用DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。①細胞增殖能力檢測：取RAECs，分別加入不同濃度（0、50、100、150、200 μg/mL）Ox-LDL 作用24、48、72 h，使用CCK-8 試劑盒檢測細胞活力，上酶標儀檢測450 nm波長處的OD 值，實驗重復(fù)3 次取平均值。結(jié)果顯示：與0 μg/mL Ox-LDL 作用相同時間點比較，150、200 μg/mL Ox-LDL 作用48、72 h 的OD 值均降低（P均＜0.01），以200 μg/mL Ox-LDL 作用72 h 的OD值降低幅度最大。見表1。②細胞脂質(zhì)泡沫化情況觀察：取RAECs，分別加入不同濃度（0、50、100、150、200 μg/mL）Ox-LDL 作用72 h。將油紅O 粉末溶解在異丙醇中，用蒸餾水將油紅O 原液稀釋至0.3%，并通過0.22 μm 過濾器過濾。室溫下4%多聚甲醛固定1 h，油紅O 溶液進行染色，5 min 后顯微鏡下觀察，含有油紅O 陽性脂肪滴的細胞為泡沫細胞。結(jié)果顯示，200 μg/mL Ox-LDL 作用72 h 的RAECs脂質(zhì)泡沫化程度最高。見OSID碼圖1。

表1 RAECs經(jīng)不同濃度Ox-LDL作用不同時間后的細胞增殖能力比較（）

表1 RAECs經(jīng)不同濃度Ox-LDL作用不同時間后的細胞增殖能力比較（）

注：與0 μg/mL Ox-LDL作用相同時間比較，*P＜0.05，#P＜0.01。

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1.3 細胞分組及不同劑量膽?zhàn)龇教幚?選擇對數(shù)生長期的RAECs，以1 × 104/孔接種于96 孔板中，使用DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將RAECs 隨機分為六組，即對照組、模型組、膽?zhàn)龇降蛣┝拷M、膽?zhàn)龇街袆┝拷M、膽?zhàn)龇礁邉┝拷M及阿托伐他汀組。除對照組外，其余五組均給予200 μg/mL的Ox-LDL灌胃作用72 h，膽?zhàn)龇降汀⒅小⒏邉┝拷M及阿托伐他汀組分別給予50、100、200 μg/L 膽?zhàn)龇剿幰杭鞍⑼蟹ニ?00 μg/L灌胃。

1.4 細胞增殖能力檢測 參照“1.2”，采用CCK-8法檢測各組分組處理后24、48、72 h 的OD 值，以此表示細胞增殖能力。

1.5 細胞脂質(zhì)泡沫化情況觀察 取分組處理后72 h 的各組細胞，采用油紅O 染色觀察各組細胞脂質(zhì)泡沫化情況。

1.6 細胞TNF-α、IL-6 蛋白檢測 采用ELISA 法。取分組處理72 h 的各組細胞，使用ELISA 檢測試劑盒檢測TNF-α、IL-6 表達，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 細胞ROS 含量檢測 采用二羥甲基熒光素（DCFH-DA）氧化熒光反應(yīng)。取分組處理后72 h 的各組細胞，以5 × 104/mL 接種在6 孔板中，除去培養(yǎng)基。加入DCFH-DA 熒光探針1.5 mL，37 ℃條件下作用25 min。200 倍熒光顯微鏡下觀察細胞熒光情況，以此表示ROS含量。

1.8 細胞上清液MDA和SOD水平檢測 采用ELISA法。取分組處理72 h 的各組細胞，置于冷生理鹽水中，勻漿機勻漿，3 000 r/min離心15 min，分離細胞上清液。使用ELISA試劑盒檢測細胞上清液MDA、SOD表達，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.9 細胞JAK2、STAT3 mRNA 檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取分組處理72 h 的各組細胞，使用TRIzol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。JAK2 引物序列：上游引物5′-AAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT-3′，下游引物5′-AGAAAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT-3′；STAT3引物序列：上游引物5′-ACCAGCAGTATAGCCGCTTC-3′，下游引物5′-GCCACAATCCGGGCAATCT-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游引物5′-GGTTTGAGCAGGTTTTT-3′，下游引物5′-GATGCCTGCTTCACCACC-3′。在MyiQ2 PCR 熱循環(huán)儀上進行PCR 反應(yīng)，2-ΔΔCt法計算JAK2、STAT3 mRNA相對表達量。

1.10 細胞JAK2、STAT3 蛋白及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 檢測 采用Westen blotting 法。取分組處理72 h的各組細胞，加入RIPA緩沖液裂解細胞，檢測總蛋白濃度合格。10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。加入含有0.05%吐溫20的Tris緩沖鹽水（TBS）稀釋的奶粉，阻斷非特異性位點。加入JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 及內(nèi)參GAPDH 的兔單克隆一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗滌3次；加入山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例均為1∶ 2 000），37 ℃條件下孵育1 h。采用增強化學(xué)發(fā)光法評價印跡，Quantity One軟件分析條帶灰度值，計算JAK2、STAT3蛋白相對表達量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用Cramer-von Mises test（CVM 檢驗）正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力比較 與對照組作用相同時間點比較，模型組OD 值均降低（P均＜0.05）；與模型組作用相同時間點比較，膽?zhàn)龇礁邉┝拷M及阿托伐他汀組OD 值均升高，膽?zhàn)龇街袆┝拷M作用48、72 h的OD值均升高（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組不同時間點細胞增殖能力比較（）

表2 各組不同時間點細胞增殖能力比較（）

注：與對照組作用相同時間比較，*P＜0.05；與模型組作用相同時間比較，#P＜0.05；與阿托伐他汀組作用相同時間比較，△P＜0.05。

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2.2 各組細胞脂質(zhì)泡沫化情況比較 對照組細胞無脂質(zhì)泡沫化情況，模型組細胞脂質(zhì)泡沫化明顯；與模型組比較，阿托伐他汀組及膽?zhàn)龇礁摺⒅小⒌蛣┝拷M細胞脂質(zhì)泡沫化均得到改善，膽?zhàn)龇礁邉┝拷M和阿托伐他汀組細胞脂質(zhì)泡沫化緩解最明顯，幾乎趨近于對照組。見OSID碼圖2。

2.3 各組細胞TNF-α、IL-6、ROS 及上清液MDA、SOD 表達比較 與對照組比較，模型組細胞TNF-α、IL-6、ROS 及上清液MDA 表達均升高，上清液SOD表達降低（P均＜0.05）。與模型組比較，阿托伐他汀組及膽?zhàn)龇礁摺⒅小⒌蛣┝拷M細胞TNF-α、IL-6、ROS及上清液MDA 表達均降低，上清液SOD 表達均升高，以阿托伐他汀組及膽?zhàn)龇礁邉┝拷M變化更明顯（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組細胞TNF-α、IL-6、ROS及上清液MDA、SOD表達比較（）

表3 各組細胞TNF-α、IL-6、ROS及上清液MDA、SOD表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與阿托伐他汀組及膽?zhàn)龇礁邉┝拷M比較，△P＜0.05。

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2.4 各組細胞JAK2、STAT3 mRNA、蛋白相對表達量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 比較 與對照組比較，模型組細胞JAK2、STAT3 mRNA 相對表達量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 均升高（P均＜0.05）。與模型組比較，阿托伐他汀組及膽?zhàn)龇礁摺⒅小⒌蛣┝拷M細胞JAK2、STAT3 mRNA 相對表達量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 均降低，以阿托伐他汀組及膽?zhàn)龇礁邉┝拷M降低更明顯（P均＜0.05）。各組細胞JAK2、STAT3蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表4及OSID碼圖3。

表4 各組細胞JAK2、STAT3 mRNA、蛋白相對表達量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與阿托伐他汀組及膽?zhàn)龇礁邉┝拷M比較，△P＜0.05。

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3 討論

AS是動脈硬化中最常見的類型，在人體重要器官均可發(fā)生，并且在引起急性心腦血管疾病（如心梗和腦梗）之前可以很多年都沒有臨床癥狀。AS主要表現(xiàn)為大、中動脈內(nèi)膜的脂質(zhì)沉積、平滑肌細胞和基質(zhì)增生，炎癥細胞浸潤，內(nèi)膜增厚，血栓形成，最終導(dǎo)致管腔狹窄，嚴重時會出現(xiàn)閉塞［5］。冠狀動脈一旦發(fā)生AS，其損傷數(shù)量隨年齡增加，管腔出現(xiàn)不同程度狹窄，并伴有血栓形成，導(dǎo)致血液循環(huán)障礙［6-7］。因此，人體出現(xiàn)AS 后需要積極治療，防止斑塊進展［8-9］。阿托伐他汀是治療AS 的常用藥物，其治療作用已被臨床證實［10］，因此本研究選擇阿托伐他汀作為陽性對照藥物。越來越多的研究表明，部分中藥或者中藥成分能夠用于治療AS［11-12］。膽?zhàn)龇绞俏铱浦委煿谛牟⌒慕g痛的經(jīng)驗方，方中半夏燥濕化痰，竹茹清熱化痰，陳皮理氣健脾、燥濕化痰；丹參、水蛭活血化瘀、搜風(fēng)剔絡(luò)；茯苓、黃芪健脾益氣、利水祛濕，可杜生痰之源；治痰治血先理氣，氣順則痰化瘀消，方中檀香、砂仁、桔梗、枳殼均具有寬胸理氣之功效，以助化痰活血；甘草調(diào)和諸藥；諸藥配伍，共奏健脾化痰降濁、益氣活血化瘀之效。但是，膽?zhàn)龇降淖饔脵C制，尤其是其治療AS的作用機制尚不清楚。

在AS發(fā)生發(fā)展過程中，起到關(guān)鍵性作用的內(nèi)皮細胞除了建立屏障與運輸營養(yǎng)物質(zhì)外，還具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能，具有預(yù)防血栓、調(diào)節(jié)血管舒縮和局部血流，降低血管通透性，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥，促進血管新生，抑制細胞遷移和增殖等作用［13］。此外，內(nèi)皮細胞作為一類傳遞信號的細胞，當細胞膜受體感知到化學(xué)性或者物理性變化后，會分泌多種生物活性物質(zhì)［14］。當血管內(nèi)皮細胞受到各種AS 病理因子的反復(fù)刺激后，其結(jié)構(gòu)功能遭到破壞，通透性增強，導(dǎo)致動脈硬化的大分子物質(zhì)如LDL 隨即進入內(nèi)皮下間隙，氧化后被巨噬細胞吞噬，形成泡沫細胞［15］；同時，內(nèi)皮細胞的代謝功能也隨之發(fā)生變化，通過釋放各種細胞因子發(fā)揮促進炎癥和凝血的作用，從而形成血栓，最終導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生［16］。因此，內(nèi)皮細胞功能異常不僅是AS形成之前的一個早期表現(xiàn)，更是重要的啟動及致病因素之一［17］。本研究以O(shè)x-LDL刺激RAECs 脂質(zhì)泡沫化模擬發(fā)生AS 的內(nèi)皮細胞，并采用不同劑量膽?zhàn)龇竭M行處理；結(jié)果顯示，高劑量膽?zhàn)龇教幚砗蠹毎鲋衬芰ι撸抑|(zhì)泡沫化情況比較輕，幾乎趨近于對照組；這提示高劑量膽?zhàn)龇娇梢蕴岣逴x-LDL 刺激后RAECs 的增殖能力，并減輕其脂質(zhì)泡沫化。

炎癥反應(yīng)參與了AS 的各個階段，貫穿AS 不同階段損傷，其中IL-6、TNF-α 是最重要的炎癥因子。IL-6 在AS 的炎癥反應(yīng)中起核心調(diào)節(jié)作用，是參與AS 形成的一個重要炎癥因子，與AS 斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)［18］。TNF-α是一種對多種細胞的生長分化等功能發(fā)揮抑制或刺激效應(yīng)的因子，其主要生物學(xué)活性為激活炎癥反應(yīng)。TNF-α可刺激內(nèi)皮細胞合成E-選擇素，激活平滑肌細胞產(chǎn)生IL-6［19］。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-6 可促使內(nèi)皮細胞產(chǎn)生ROS，使眾多促炎因子表達增加，炎癥反應(yīng)與細胞增殖形成惡性循環(huán)，促進AS 斑塊生長并導(dǎo)致其穩(wěn)定性下降［20］。本研究結(jié)果顯示，Ox-LDL刺激后的RAECs TNF-α和IL-6表達均升高，經(jīng)過膽?zhàn)龇郊鞍⑼蟹ニ√幚砗缶档停愿邉┝磕戰(zhàn)龇郊鞍⑼蟹ニ∽饔米蠲黠@；這提示高劑量膽?zhàn)龇侥軌蚪档虯S 過程中內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)。

ROS 累積負荷會擾亂氧化還原的動態(tài)平衡，損傷細胞內(nèi)DNA、脂類和蛋白質(zhì)等細胞大分子，導(dǎo)致生物膜脂質(zhì)受到過氧化損傷，進而損傷內(nèi)皮細胞，減少內(nèi)皮細胞的一氧化氮合成與生物利用度［21］。氧化應(yīng)激還可激活細胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子表達，使炎癥因子和趨化因子表達升高，引起動脈內(nèi)皮細胞的損傷［22］。MDA 是ROS 攻擊細胞膜所形成的脂質(zhì)過氧化代謝終產(chǎn)物，其含量可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，MDA 升高提示氧化應(yīng)激損傷加重，反之則說明氧化應(yīng)激損傷減輕［23］。SOD具有清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的作用，對維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、保護血管內(nèi)皮免受過氧化損傷等發(fā)揮重要作用。研究顯示，SOD活性增強能抑制細胞介導(dǎo)的LDL過氧化，減少Ox-LDL 形成，阻止巨噬細胞對脂類的過度攝取，減少泡沫細胞形成，SOD變化可反映細胞遭受氧化應(yīng)激的水平［24］。本研究結(jié)果顯示，Ox-LDL刺激后RAECs ROS 和MDA 表達均升高、SOD 表達降低，經(jīng)過膽?zhàn)龇郊鞍⑼蟹ニ√幚砗驲OS 和MDA 表達均降低、SOD表達升高，以高劑量膽?zhàn)龇郊鞍⑼蟹ニ∽饔米蠲黠@；這提示高劑量膽?zhàn)龇娇蓽p輕Ox-LDL引起的內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷。

JAK2/STAT3 通路最開始是在腫瘤微環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)，近年來研究發(fā)現(xiàn)其對炎癥反應(yīng)具有重要影響，可以引起IL-6、TNF-α 等下游炎癥因子表達［26］。抑制JAK2/STAT3 通路激活可有效緩解AS 患者的組織炎癥反應(yīng)，抑制炎癥因子分泌，有效抑制高脂飲食誘發(fā)的AS［25］。JAK2 和STAT3 的磷酸化是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活力和功能的最核心機制，是蛋白具有生物學(xué)活性的重要標志，提示JAK2/STAT3 通路處于激活狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，Ox-LDL刺激后RAECs JAK2、STAT3 mRNA 相對表達量及p-JAK2/JAK2 、p-STAT3/STAT3 均升高，膽?zhàn)龇侥軌蛴行Ы档蜕鲜鲋笜耍鹘M細胞JAK2、STAT3 蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；這提示Ox-LDL 刺激后RAECs 的JAK2/STAT3 信號通路被激活，而膽?zhàn)龇侥軌蛞种艼AK2/STAT3信號通路激活。

綜上所述，膽?zhàn)龇剿幰嚎梢种芆x-LDL 誘導(dǎo)的RAECs 脂質(zhì)泡沫化，以高劑量膽?zhàn)龇剿幰鹤饔酶黠@，其機制可能與抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。