黑果小檗果花色苷提取物對小鼠肝纖維化的改善作用及其機制

孫吉祥，李倩，劉菁，姚俊英，范旻

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)研究所，烏魯木齊 830001

肝纖維化是各類有害因子對肝臟造成損害后表現(xiàn)出的一種病理狀態(tài)。肝纖維化具有向肝硬化轉(zhuǎn)變的病理基礎(chǔ)，進一步發(fā)展將導致肝臟功能衰竭，最終危及生命［1］。目前研究已經(jīng)明確，導致肝纖維化的重要原因是肝臟內(nèi)細胞外基質(zhì)（ECM）合成與降解紊亂，而肝臟內(nèi)固有的肝星狀細胞（HSC）是最重要的ECM 來源［2］。肝纖維化是一種動態(tài)的雙向進程，具有恢復和重塑的內(nèi)在能力，對肝纖維化進行早期積極干預，是有望實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)其疾病進程的。近幾年對肝纖維化的研究主要集中在促進HSC 凋亡以及抑制HSC 激活等方面［3-4］。花色苷是一類多羥基的類黃酮化合物，具有黃酮類化合物C6-C3-C6的特征骨架結(jié)構(gòu)，由兩個芳香環(huán)和一個含氧雜環(huán)組成［5］。近年來，花色苷的抗氧化能力、抑制炎癥反應和抑制相關(guān)酶與蛋白表達的作用得到了肯定［6］。水飛薊賓是臨床常用的保肝藥物，被證實具有穩(wěn)定肝細胞膜、維持肝細胞完整性作用，可以使毒素無法穿透破壞肝臟，并能加速合成肝臟細胞的去氧核糖核酸（DNA），可預防肝硬化、脂肪肝、膽管炎等疾病［7］。2021年9月—2022 年9 月，本研究采取腹腔注射CCl4的方法建立肝纖維化小鼠模型，以水飛薊賓為陽性對照藥物，觀察黑果小檗果花色苷提取物（BHSTA）對小鼠的肝臟保護作用，并探討其可能的作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性昆明種小鼠40 只，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心實驗動物研究中心，動物許可證號SCXK（新）2016-0003；實驗小鼠飼養(yǎng)于石河子大學藥學院動物房，在自然晝夜節(jié)律光照下，自由進食進水，環(huán)境溫度18～26 ℃，相對濕度65%～80%，適應性飼養(yǎng)5 d。主要試劑：CCl4購自南京化學試劑股份有限公司，陽性對照藥物水飛薊賓購自天津天士力圣特制藥公司，氧化應激相關(guān)指標丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）及其下游靶基因凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）、半胱天冬酶1（Caspase-1）、白細胞介素1β（IL-1β）相關(guān)抗體均購自美國ABCam公司。

1.2 BHSTA 的提取、純化及溶液配置 成熟的黑果小檗果實購自新疆烏魯木齊市水西溝鎮(zhèn)南山山區(qū)，用藥材粉碎機將果皮粉碎、過20 目篩，-20 ℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩︴r果的營養(yǎng)成分進行測定，再分別測定70%甲醇、乙醇、丙酮溶劑提取物的總酚、總花色苷含量，并檢測其DPPH 自由基、羥自由基、ABTS 自由基、超氧陰離子自由基等抗氧化活性相關(guān)指標。通過響應面法優(yōu)化BHSTA 的超聲輔助提取工藝，確定相應的優(yōu)化工藝參數(shù)。采用XDA-7A 大孔樹脂對BHSTA 粗提物進行純化，進一步得到BHSTA 純化物凍干粉。分別稱取BHSTA 1.0、4.0 g，加入到100 mL水中，攪拌均勻，得到質(zhì)量濃度分別為10、40 mg/mL的BHSTA溶液。

1.3 動物分組與BHSTA處理 40只雄性昆明種小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組、模型對照組、BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組，每組8只。除正常對照組外，其余各組小鼠腹腔注射CCl4油劑（CCl4∶ 橄欖油=1∶ 4）3 μL/g，2 次/周，連續(xù)4周，建立肝纖維化模型；正常對照組腹腔注射等體積橄欖油。BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組腹腔注射CCl4油劑開始建模后，分別灌胃給予10、40 mg/kg 的BHSTA 溶液和1 μg/10 g的水飛薊賓，1次/天，連續(xù)4周；正常對照組、模型對照組均灌胃給予等體積蒸餾水。

1.4 體質(zhì)量觀察 記錄各組小鼠分組處理0 ～ 4周的體質(zhì)量。

1.5 肝臟指數(shù)分析及肝臟組織病理觀察 各組末次給藥后禁食12 h，稱取體質(zhì)量后摘眼球取血，處死并進行解剖；剝離完整肝臟，生理鹽水清洗，濾紙蘸干表面水分，肉眼觀察肝臟大體形態(tài)。稱取并記錄肝臟質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/末次體質(zhì)量×100%。取各組小鼠新鮮肝臟左葉組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片。HE染色后觀察肝臟組織病理情況，包括肝細胞變性、壞死、細胞排列、小葉結(jié)構(gòu)、有無假小葉、纖維組織增生等；Masson染色后觀察肝臟組織炎癥細胞浸潤和膠原纖維增生情況。剩余肝臟組織保存于液氮中。

1.6 肝臟功能檢測 取各組小鼠眼球血，離心后分離血清，使用全自動生化分析儀檢測肝臟功能相關(guān)指標，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。

1.7 肝臟組織SOD、GSH、MDA 表達檢測 取各組小鼠部分新鮮肝臟組織，進行組織勻漿，采用改良鹽酸羥胺法檢測SOD、GSH、MDA表達。

1.8 肝臟組織NLRP3 及其下游靶基因蛋白檢測采用Western blotting 法。取各組保存于液氮中的肝臟組織，冰上剪取質(zhì)量為100 mg 的肝臟組織，采用預冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙擦干后放入干凈的燒杯內(nèi)。用干凈消毒的手術(shù)剪刀反復剪切，稱取質(zhì)量后加入9 倍的裂解液RIPA 進行裂解，同時加入蛋白酶抑制劑。進行蛋白抽提前再加入0.1%苯甲基磺酰氟，進行組織勻漿，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min。取上清液，加入NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 及內(nèi)參GAPDH 一抗及二抗。使用Chemi-Scopemini 化學發(fā)光儀檢測、拍照，凝膠掃描成像系統(tǒng)進行掃描，Image J 軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用S-W 正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊的兩組間比較采用LSD-t檢驗，方差不齊的兩組間比較采用Dunnett-t檢驗，重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量比較 模型對照組、BHSTA高劑量組各死亡1 只。隨著干預時間的延長，各組小鼠體質(zhì)量均呈升高趨勢。分組處理第4 周，正常對照組、水飛薊賓組、BHSTA 高劑量組、BHSTA 低劑量組、模型對照組小鼠體質(zhì)量依次降低，組間兩兩比較P均＜0.05。見表1。

表1 各組不同時間點體質(zhì)量比較（）

表1 各組不同時間點體質(zhì)量比較（）

注：與正常對照組同時間點比較，*P＜0.05；與水飛薊賓組同時間點比較，#P＜0.05；與BHSTA 高劑量組同時間點比較，△P＜0.05；與BHSTA低劑量組同時間點比較，▲P＜0.05。

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2.2 各組小鼠肝臟指數(shù)比較 正常對照組、水飛薊賓組、BHSTA 高劑量組、BHSTA 低劑量組、模型對照組小鼠肝臟指數(shù)分別為4.84% ± 0.67%、5.29% ±1.01%、5.56% ± 0.91%、5.90% ± 0.95%、6.40% ±0.95%；與正常對照組比較，其余各組肝臟指數(shù)均升高，以模型對照組升高最明顯（P均＜0.05）， 水飛薊賓組、BHSTA 高劑量組、BHSTA 低劑量組、模型對照組小鼠肝臟指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

2.3 各組小鼠肝臟大體形態(tài)比較 正常對照組小鼠肝臟呈粉紅色，表面光滑，色澤光鮮，質(zhì)地柔軟，容易夾碎。模型對照組小鼠肝臟暗紅，肝臟表面呈細顆粒狀，邊緣變鈍。水飛薊賓組小鼠肝臟被膜、質(zhì)地、顏色接近對照組，與模型對照組差異較為明顯。BHSTA 低劑量組小鼠肝臟顏色和質(zhì)地較模型對照組有所改善，部分仍有淤血現(xiàn)象。BHSTA 高劑量組小鼠肝臟質(zhì)地進一步改善，基本沒有淤血現(xiàn)象，與模型對照組差異較為明顯。見OSID碼圖1。

2.4 各組肝臟組織病理觀察結(jié)果比較

2.4.1 HE染色結(jié)果 正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)比較完整，肝細胞正常，基本無變性壞死，無脂肪浸潤，匯管區(qū)未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤。模型對照組大多數(shù)肝竇消失，肝細胞可見中度或者重度水腫改變，多發(fā)氣球樣及脂肪樣變性，并伴有炎癥細胞浸潤。BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組肝細胞氣球樣變及炎癥細胞浸潤較模型對照組有所減輕。見OSID碼圖2。

2.4.2 Masson染色結(jié)果 正常對照組匯管區(qū)未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤和膠原纖維增生情況，僅在中央靜脈等血管周圍發(fā)現(xiàn)少量膠原纖維。模型對照組可見大量的膠原纖維增生，主要分布在匯管區(qū)和血管周圍，沿匯管區(qū)或炎癥壞死區(qū)可見膠原纖維向外延伸。BHSTA低劑量組、BHSTA高劑量組、水飛薊賓組膠原纖維增生減輕，主要分布在血管區(qū)。見OSID 碼圖3。

2.5 各組小鼠血清AST、ALT 水平及肝臟組織SOD、GSH、MDA 表達比較 與正常對照組比較，模型對照組血清AST、ALT 水平及肝臟組織MDA 表達均升高，肝臟組織SOD、GSH 表達均降低（P均＜0.05）。與模型對照組比較，BHSTA低劑量組、BHSTA高劑量組、水飛薊賓組血清AST、ALT 水平及肝臟組織MDA 表達均降低，肝臟組織SOD、GSH 表達均升高；其中，BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組血清AST、ALT 及肝臟組織MDA 表達降低更明顯，水飛薊賓組肝臟組織SOD、GSH 表達升高更明顯（P均＜0.05）。見表2及OSID碼圖4。

表2 各組小鼠血清AST、ALT水平及肝臟組織SOD、GSH、MDA表達比較（）

表2 各組小鼠血清AST、ALT水平及肝臟組織SOD、GSH、MDA表達比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與水飛薊賓組比較，#P＜0.05；與BHSTA高劑量組比較，△P＜0.05；與BHSTA低劑量組比較，▲P＜0.05。

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2.6 各組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、Caspase-1 及IL-1β 蛋白相對表達量比較 與正常對照組比較，BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組及模型對照組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β蛋白相對表達量均升高，以模型對照組升高最明顯（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白相對表達量比較（）

表3 各組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白相對表達量比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與水飛薊賓組比較，#P＜0.05；與BHSTA高劑量組比較，△P＜0.05；與BHSTA低劑量組比較，▲P＜0.05。

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3 討論

花色苷在保護肝臟方面顯示出較好的生物學活性，目前其在抗肝纖維化、抗化學性肝損傷、抗酒精性肝損傷、抗肝癌、防治非酒精性脂肪肝等研究中的作用已較為明確［8-13］。研究顯示，花色苷的肝臟保護作用與其抗氧化能力、抑制炎癥反應與氧化應激反應等有關(guān)［14］。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠體質(zhì)量降低，肝臟指數(shù)及血清AST、ALT升高；病理結(jié)果顯示大多數(shù)肝竇消失，肝細胞可見中度或者重度水腫改變，多發(fā)氣球樣及脂肪樣變性，并伴有炎癥細胞浸潤，同時有大量膠原纖維增生；提示成功采用腹腔注射CCl4的方法建立小鼠肝纖維化模型。

水飛薊賓的主要成分是從水飛薊種子中提取的一種化合物，可通過穩(wěn)定肝細胞膜、清除氧自由基發(fā)揮保肝作用，主要用于治療急慢性肝炎、脂肪肝等導致的肝臟功能異常，是一種輔助治療肝病的藥物。因此，本研究選用水飛薊賓作為陽性對照藥物。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組體質(zhì)量均升高而血清AST、ALT 水平均降低，肝細胞氣球樣變、炎癥細胞浸潤及膠原纖維增生均有所減輕，且BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組血清AST、ALT 降低更明顯。這提示BHSTA 可以有效阻斷小鼠肝臟組織纖維化進展，緩解炎癥反應對肝細胞的損傷，達到減輕CCl4引起肝損傷的目的，具有一定的肝臟保護作用，且高劑量應用效果更明顯，這與以往關(guān)于花色苷抗肝纖維化的研究結(jié)果一致［15-16］。

CCl4腹腔注射后經(jīng)門靜脈入肝，轉(zhuǎn)化為三氯甲基自由基（CCl3·）等大量自由基，可以活化HSC，釋放大量炎癥細胞因子及ROS。ROS是一類氧衍生的分子，包括超氧化物、羥自由基、烷氧基、過氧化氫、臭氧等，其產(chǎn)生是機體或細胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生與清除失衡所導致的。ROS不僅可以通過刺激免疫細胞釋放促纖維化因子，還可直接刺激HSC 的增殖與活化［17］。研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化患者體內(nèi)均存在大量自由基，機體抗氧化酶系統(tǒng)紊亂，表現(xiàn)為SOD、NOQ1、GSH 等表達異常。本研究選擇了GSH、SOD、MDA這三個抗氧化指標，評價BHSTA 對CCl4致小鼠肝損傷的影響；結(jié)果顯示，與模型對照組比較，BHSTA 低劑量組、BHSTA 高劑量組、水飛薊賓組肝臟組織MDA表達均降低，SOD、GSH表達均升高，其中BHSTA高劑量組、水飛薊賓組肝臟組織MDA 表達降低更明顯，水飛薊賓組肝臟組織SOD、GSH 表達升高更明顯；這提示BHSTA 有助于減輕肝臟的氧化應激反應，提高其抗氧化作用及氧自由基的清除能力，從而使肝臟細胞免受自由基攻擊，發(fā)揮肝臟保護作用。王治博等［18］研究發(fā)現(xiàn)，花色苷對提高CCl4所致急性肝損傷大鼠血清或肝臟組織抗氧化指標有積極作用。此外，花色苷可以使糖尿病大鼠血液中過氧化氫酶、SOD、GSH 水平升高［19］。李衛(wèi)霞等［20］研究顯示，低劑量的花色苷提取物可以提高肝損傷小鼠肝臟組織中的SOD 和GSH 表達。但是不同來源的花色苷提取物是否均具有這種抗氧化性能，仍需進一步探討。

NLRP3 炎癥小體在肝臟多種細胞中都有表達，在庫普弗細胞和竇內(nèi)皮細胞中表達最多，其次是門脈周圍的肌成纖維細胞和HSC，這也充分說明在炎癥加重肝損傷和肝纖維化的同時，在細胞水平不僅僅有巨噬細胞NLRP3 炎癥小體的活化，肝細胞及HSC 中的NLRP3 炎癥小體活化也參與了這一過程。不受限制的NLRP3 炎癥小體激活會導致肝細胞生存時間縮短，嚴重肝病患者的病理特征是中性粒細胞浸潤和HSC 激活，并在肝臟中形成膠原纖維沉積。研究顯示，IL-1β 或IL-18 受體Ⅰ型敲除的小鼠肝纖維化模型的肝纖維化程度得到明顯改善，而IL-1β 拮抗劑基因敲除小鼠表現(xiàn)出肝纖維化的快速進展，同時肝臟組織IL-1β、TGF-β1表達升高［21］。崔東娟等［22］研究發(fā)現(xiàn)，香葉木素通過抑制NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 表達來緩解肝纖維化。王文杰等［23］研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸可以通過抗氧化及抑制NLRP3炎癥小體生成來抑制酒精性肝病（ALD）的肝臟損傷，為ALD 的預防及治療提供一定的借鑒及依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，其余四組小鼠肝臟組織NLRP3、ASC、Caspase-1 及IL-1β 蛋白相對表達量均升高，以模型對照組升高最明顯；這提示肝纖維化小鼠存在NLRP3炎癥小體活化，而BHSTA可以抑制NLRP3 炎癥小體活化，這可能是其減輕肝纖維化的重要機制之一。此外，ROS 作為細胞的第二信使，參與了對NLRP3 炎癥小體活化過程的調(diào)節(jié)，被認為是NLRP3 炎癥小體活化的關(guān)鍵上游效應因子［24］。研究顯示，ROS能夠活化HSC-T6細胞中的NLRP3炎癥小體及其下游效應分子，初步證實HSC-T6細胞中NLRP3 炎癥小體活化對肝纖維化進展具有促進作用［25］。因此，清除過多的ROS 也是防治肝纖維化的重要環(huán)節(jié)。

綜上所述，BHSTA 對小鼠肝纖維化具有一定的改善作用，其機制可能與減輕氧化應激反應及抑制NLRP3 炎癥小體相關(guān)通路有關(guān)。但是，花色苷屬于離子型化合物，親水性強、脂溶性差，其應用方式僅僅停留在泡飲使用上，生物利用度較差，且相關(guān)藥物研發(fā)或者功能性食品的開發(fā)未有顯著進展，這是未來研究的重點。