番茄紅素調節RAS同源基因家族成員A/Rho相關激酶信號通路對氧化低密度脂蛋白誘導腦血管內皮細胞凋亡的影響

張君臣, 徐武華, 鐘 麗

[1. 四川省中江縣人民醫院 神經內科, 四川 德陽, 618100; 2. 暨南大學附屬廣州紅十字會醫院康復醫學科(神經內科二區), 臨床病態營養研究所, 廣東 廣州, 510220;3. 四川省宜賓市第二人民醫院, 四川 宜賓, 644002]

動脈粥樣硬化(AS)最初由內皮功能障礙引發,其特征是致AS脂蛋白成分的流入[1]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)已被證明參與AS的形成過程,其誘發的血管內皮細胞(EC)損傷是AS的早期發病機制之一[2]。減少ox-LDL誘導的EC損傷并進一步解釋其機制可能是預防和治療AS的潛在策略。番茄紅素(LYC)是一種廣泛使用的抗氧化劑,可以修復動物生物體和細胞的氧化損傷。LYC對多種類型的疾病具有預防或治療作用,例如心腦血管疾病、癲癇、癌癥等[3]。研究[4]發現, LYC可通過減輕過氧化氫(H2O2)激活的內皮細胞氧化損傷,并抑制細胞凋亡,有助于預防AS。GUO W H等[5]發現, LYC可減輕氧化應激誘導的人EC損傷。

RAS同源基因家族成員A(RhoA)/Rho相關激酶(ROCK)信號通路是研究AS的重要通路,抑制RhoA/ROCK信號通路可有效改善慢性間歇性缺氧(IH)加重的內皮屏障損傷和AS[6]。BABAAHMADI-REZAEI H等[7]研究發現, RhoA/ROCK信號通路抑制劑可以減少蛋白多糖合成和AS斑塊的形成, ROCK抑制劑可能在抑制或減緩AS形成方面具有潛在的治療作用。LYC是否可以通過調控RhoA/ROCK信號通路對人腦微血管內皮細胞(HBMECs)產生影響還尚無報道。本研究探討LYC是否可以通過抑制RhoA/ROCK信號通路對HBMECs細胞凋亡產生影響,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

HBMECs購自武漢賽奧斯生物科技有限公司; RhoA/ROCK信號通路激活劑溶血磷脂酸(LPA)購自深圳市健竹科技有限公司; LYC購自上海源葉生物科技有限公司; ox-LDL購自廣州奕源生物科技有限公司; 單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)購自武漢菲恩生物科技有限公司,人白細胞介素(IL)-6試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司; 血管內皮細胞黏附分子1(VCAM-1)試劑盒購自上海生工; Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自弗元(上海)生物科技有限公司; CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司; 兔抗人RhoA一抗、兔抗人ROCK1一抗、兔抗人BCL-2相關X蛋白(Bax)一抗、兔抗人B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)一抗、兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-Caspase-3)一抗、兔抗人血小板內皮細胞黏附分子-1(CD31)一抗、兔抗人平滑肌(SM)22α一抗、兔抗人GAPDH抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養及分組

將HBMECs置于37 ℃、5%CO2的培養箱中,在補充有5%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的EGM-2培養基中培養。采用50 mg/mL ox-LDL處理HBMECs[8],將采用ox-LDL處理的HBMECs分為ox-LDL組、LYC組(0.5 μmol/L LYC處理HBMECs)[5]、LPA組(5 μmol/L RhoA/ROCK信號通路激活劑LPA處理HBMECs)[9]、LYC+LPA組(0.5 μmol/L LYC以及5 μmol/L LPA共同處理HBMECs), 未做任何處理的HBMECs記為NC組,處理24 h后用于后續實驗。

1.3 觀察指標

① 采用ELISA試劑盒檢測HBMECs中MCP-1、IL-6、VCAM-1的水平。② 采用CCK-8法檢測HBMECs增殖情況。將HBMECs接種在96孔板上(1×104個/孔),分組處理24 h后,添加10 μL CCK-8在37 ℃下孵育2 h。采用微孔板讀取器測量450 nm處的吸光度。③ 采用流式細胞術檢測HBMECs凋亡率。收集各組HBMECs, 結合緩沖液重懸后(1×105個/mL), 添加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI, 并在室溫下黑暗中進行反應15 min。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。細胞凋亡率是根據第2、4象限數據相加統計。④ Western blot檢測細胞CD31、SM22α、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、RhoA/ROCK通路相關蛋白表達。采用RIPA裂解緩沖液裂解每組中的HBMECs。采用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質,然后轉印到PVDF膜上。將膜與5%脫脂乳緩沖液孵育1 h以防止非特異性結合,然后與一抗孵育: RhoA(1∶1 000)、ROCK1(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、cleaved-Caspase-3(1∶5 000)、Bcl-2(1∶500)、CD31(1∶1 000)、SM22α(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體。在洗滌后,采用過氧化物酶偶聯的二級抗體(1∶1 000)孵育1 h后,通過增強型化學發光檢測試劑檢測膜中的蛋白質條帶,并通過Image J軟件檢測目的條帶灰度值。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 LYC對細胞MCP-1、IL-6、VCAM-1水平的影響

與NC組相比, ox-LDL組MCP-1、IL-6、VCAM-1水平增高; 與ox-LDL組相比, LYC組MCP-1、IL-6、VCAM-1水平降低, LPA組MCP-1、IL-6、VCAM-1水平升高; 與LYC組相比, LYC+LPA組MCP-1、IL-6、VCAM-1水平升高; 上述組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 LYC對細胞MCP-1、IL-6、VCAM-1水平的影響 pg/mL

2.2 LYC組對細胞增殖的影響

與NC組相比, ox-LDL組OD值降低; 與ox-LDL組相比, LYC組OD值升高, LPA組OD值降低; 與LYC組相比, LYC+LPA組OD值降低; 上述組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 LYC組對細胞增殖的影響

2.3 LYC對細胞凋亡率以及凋亡蛋白水平的影響

與NC組相比, ox-LDL組HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平增高, Bcl-2蛋白水平降低; 與ox-LDL組相比, LYC組HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平降低, Bcl-2蛋白水平升高,而LPA組HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平升高, Bcl-2蛋白水平降低; 與LYC組相比, LYC+LPA組HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平增高, Bcl-2蛋白水平降低; 上述組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1、圖2、表3。

表3 LYC對細胞凋亡率、凋亡相關蛋白表達的影響

2.4 LYC對細胞CD31、SM22α蛋白水平的影響

與NC組相比, ox-LDL組細胞CD31蛋白水平下降, SM22α蛋白水平增加; 與ox-LDL組相比, LYC組CD31蛋白水平升高, SM22α蛋白水平降低,而LPA組CD31蛋白水平降低, SM22α蛋白水平升高; 與LYC組相比, LYC+LPA組細胞CD31蛋白水平下降, SM22α蛋白水平升高; 上述組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 LYC對細胞中CD31、SM22α蛋白表達的影響

2.5 LYC對細胞RhoA/ROCK信號通路蛋白水平的影響

與NC組相比, ox-LDL組RhoA、ROCK1蛋白水平上調; 與ox-LDL組相比,LYC組RhoA、ROCK1蛋白水平下調,而LPA組RhoA、ROCK1蛋白水平上調; 與LYC組相比, LYC+LPA組RhoA、ROCK1蛋白水平上調; 上述組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4、表5。

表5 LYC對細胞RhoA/ROCK信號通路蛋白水平的影響

3 討 論

AS是腦血管疾病的主要原因,其患病率較高,已成為全球關注的健康問題[10-11]。內皮損傷和細胞凋亡是AS的主要病理過程,會引發血栓形成并加速AS斑塊的形成[12-14]。ox-LDL既是AS的觸發因素,也是AS的標志[15]。ox-LDL被巨噬細胞和動脈EC吸收,促進泡沫細胞的形成和EC損傷。早期研究[16]發現, ox-LDL通過激活Caspase-3級聯反應誘導EC凋亡。EC過度凋亡是AS發展的初步事件,可能是預防和治療AS的目標。研究[17]表明,天然藥物通過抑制EC凋亡來治療AS具有巨大的潛力。LYC在AS的許多階段具有積極作用[18]。LIU H等[19]發現, LYC通過抑制腸道膽固醇吸收表現出潛在的抗AS作用。LYC具有抗氧化活性,可以減少AS斑塊形成[20]。DUAN H等[17]也發現LYC可以通過抑制EC凋亡來治療AS。上述研究提示, LYC可能是治療AS的潛在治療藥物。本研究發現, ox-LDL處理后HBMECs的OD值顯著下降,而LYC處理使HBMECs細胞OD值顯著升高,提示LYC可能促進HBMECs的生長,對AS的治療起到積極影響。

ox-LDL通過誘導血管內皮炎癥和細胞凋亡來促進AS斑塊的形成和發展。ox-LDL對血管壁的損傷表現為促進脂質沉積、炎癥反應,釋放金屬蛋白酶,促進EC、巨噬細胞和血管平滑肌細胞凋亡[21]。在動脈壁的受傷區域發現了大量的ox-LDL積累,并且發現血管EC凋亡[22]。Bax、Bcl-2和Caspase-3在ox-LDL誘導的HUVEC中表達異常,這與ox-LDL誘導的EC損傷反應有關。此外, ox-LDL可加速MCP-1、IL-6、VCAM-1和ICAM-1等黏附分子的表達[23]。正常EC對促炎因子的反應是發生內皮-間充質轉化(EndMT), 其特征是成纖維細胞樣形態和細胞間連接重排[24]。在各種血管病變中, EC可能通過下調內皮標志物CD31 和上調 SM22α來經歷EndMT的表型轉換[25]。研究[26]表明, EndMT在心腦血管疾病的發病機制中起著關鍵作用,抑制EndMT可以對AS治療起到積極效果。本研究發現, ox-LDL誘導的HBMECs凋亡率、MCP-1、IL-6、VCAM-1、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22α水平顯著升高, Bcl-2、CD31水平顯著下降,而LYC治療后HBMECs凋亡率、MCP-1、IL-6、VCAM-1、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22α水平顯著降低, Bcl-2、CD31水平顯著升高,表明ox-LDL促進了HBMECs凋亡以及EndMT過程的發生, LYC可能通過抑制HBMECs炎癥因子水平、EndMT以及細胞凋亡來對HBMECs損傷起到保護作用。

研究[27]顯示RhoA/ROCK通路是一種重要的信號轉導系統,參與細胞增殖、內皮功能障礙、氧化應激、炎癥、血管重塑和AS。既往研究[28]表明, AS的各種危險因素和病理介質可以不同程度地激活RhoA/ROCK通路,并且抑制RhoA/ROCK通路可能是AS治療的潛在機制。此外, RhoA/ROCK通路對AS過程炎癥反應的調節作用已被研究[29]證實。本研究結果顯示, ox-LDL促進細胞RhoA、ROCK1蛋白高表達,而LYC治療后細胞RhoA、ROCK1蛋白水平顯著下降,表明ox-LDL可能通過下調RhoA/ROCK信號通路抑制HBMECs凋亡的發生。本研究使用RhoA/ROCK信號通路激活劑LPA處理ox-LDL誘導的HBMECs以及LYC治療后的HBMECs,結果發現LPA加重了ox-LDL誘導的HBMECs損傷,但減弱了LYC對ox-LDL誘導的EC凋亡的抑制作用。

綜上所述, LYC可能通過下調RhoA/ROCK信號通路抑制HBMECs凋亡以及EndMT, 對HBMECs損傷起到改善效果。