紅景天苷對1-甲基-4-苯基-1-2-3-6-四氫吡啶誘導帕金森病小鼠的作用及機制

孫梓旭, 董 霞, 趙寶民, 賈海麗, 馬曉瑞, 谷 偉

(河北北方學院附屬第一醫院 全科醫學科, 河北 張家口, 075000)

帕金森病(PD)是臨床常見的神經退行性疾病之一[1], 患者會出現運動障礙,包括運動遲緩、靜息性震顫、肌肉僵直、步態受損和神經精神障礙等[2]。近年來, PD的臨床治療技術有所進步,但目前仍無法有效減緩PD進展,因此迫切需要開發能改善PD且具有神經保護作用的藥物。α-突觸核蛋白(α-syn)積累成絲狀聚集物是PD進展的標志[3],激活核因子E2相關因子2(Nrf2)可以抑制α-syn的過度積累[4]。Nrf2-抗氧化反應元件(ARE)信號通路是一種受氧化還原信號調節的重要抗氧化通路,醌氧化還原酶1(NQO1)是Nrf2-ARE信號通路激活的重要標志,可作為檢測ARE激活的指標。Nrf2-ARE通路的激活在調控氧化應激、維持線粒體功能、抑制多巴胺能神經元鐵死亡及恢復神經元功能等方面發揮重要作用[5], 近年來已逐漸成為PD研究的熱點。紅景天苷是從傳統中藥紅景天中提取出的主要生物活性化合物之一,具有廣泛的藥理作用,如抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗輻射、抗癌和心臟保護等作用[6]。研究[7]表明,紅景天苷可能通過調節線粒體功能發揮神經保護劑作用,但具體的神經保護作用及其潛在機制尚未闡明。本研究探討紅景天苷對1-甲基-4-苯基-1-2-3-6-四氫吡啶(MPTP)誘導PD小鼠的作用及機制,以期為紅景天苷治療PD提供參考依據,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SN4741細胞(小鼠多巴胺能神經細胞)購自中科院上海細胞庫; DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶消化液購自美國HyClone公司; 青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛購自北京碧云天有限公司。

1.2 PD動物模型建立和干預

8周齡雄性C57BL/6小鼠,體質量22～25 g, 由北京中科實驗動物有限公司供應,在標準實驗動物設施環境(25 ℃, 12 h光照與黑暗交替循環)中飼養7 d, 自由取食和飲水。將40只雄性小鼠隨機分為4組,即對照組、MPTP組、MPTP+紅景天苷(30 mg/kg)組、MPTP+紅景天苷(60 mg/kg)組,每組10只。MPTP組小鼠腹腔注射MPTP(30 mg/kg, 溶于生理鹽水),對照組小鼠注射等量生理鹽水, MPTP+紅景天苷(30 mg/kg)組、MPTP+紅景天苷(60 mg/kg)組小鼠在腹腔注射MPTP的基礎上每日分別灌胃紅景天苷30、60 mg/kg。行為測試后,處死小鼠取腦組織進行后續實驗。

1.3 曠場實驗

將小鼠放置于白色方形競技場(45 cm×45 cm×60 cm), 通過競技場上方的攝像機(SR-XZ301, 日本索尼公司)連續記錄小鼠在競技場中3 min的行為,主要監測運動軌跡、距離、平均速度。采用ANYMaze動物行為分析系統(美國Stoeling公司)對小鼠軌跡進行分析。

1.4 PD細胞模型和干預

SN4741細胞購自中國科學院細胞庫,置于含10%FBS、青霉素(100 IU/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM培養基中,于37 ℃含5%二氧化碳的加濕培養箱中培養, 2～3 d更換1次培養基。將SN4741細胞按照2×105個/孔密度接種于6孔板中,分為對照組、MPTP+紅景天苷(10 μmol/L)組、MPTP+紅景天苷(50 μmol/L)組和MPTP組,其中對照組細胞以磷酸鹽緩沖液(PBS)處理, MPTP+紅景天苷(10 μmol/L)組、MPTP+紅景天苷(50 μmol/L)組細胞分別與紅景天苷(10、50 μmol/L)孵育2 h, 然后用MPTP(500 μmol/L)刺激24 h, MPTP組僅用MPTP(500 μmol/L)刺激24 h。處理結束后,收集各組細胞進行后續實驗研究。

1.5 細胞轉染實驗

SN4741細胞置于含10%FBS和1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養基中,于37 ℃、5%CO2孵箱中培養。次日,將對數生長期的SN4741細胞以1×105個/孔密度接種于6孔板,待細胞貼壁后采用無血清培養基培養,用HighGene轉染試劑按照說明書要求分別轉染si-NC和si-Nrf2以及si-NC和si-NQO1, 8 h后換液, 24 h后采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞中Nrf2表達水平。

1.6 qRT-PCR檢測方法

根據試劑盒說明書,使用TRIzol?試劑盒(賽默飛世爾科技公司)從SN4741細胞中提取總RNA, 再用PrimeScript RT Master Mix試劑盒(Takara公司)將總RNA反轉錄為cDNA, 反轉錄條件為37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。使用FastStart Universal SYBR Master Mix試劑盒進行40個循環的PCR擴增,擴增條件為95 ℃ 5 min, 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。以GAPDH為內參基因,采用2-△△Ct法分析目的基因相對表達量。si-Nrf2的干擾序列: 5′-AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA-3′; si-NQO1的干擾序列: 5′-GGACAUATTTUGACTTTACGA-3′。

1.7 免疫組織化學法

向小鼠灌注4%多聚甲醛,取出大腦組織于4%多聚甲醛中固定48 h, 然后包埋于石蠟中,切成5 μm厚的切片。切片用二甲苯脫蠟,分級乙醇水合,檸檬酸鈉緩沖液中進行抗原修復。每個樣本用5%山羊血清封閉30 min, 孵育一抗酪氨酸羥化酶(TH)(Abcam公司,ab137869, 1∶500)、α-syn(Abcam公司, ab214316, 1∶500)、Nrf2(Abcam公司,ab62352, 1∶200)和NQO1(Abcam公司,ab28947, 1∶500), 4 ℃孵育過夜。次日切片洗凈,用山羊抗兔IgG二抗孵育30 min。將切片用3-3-二氨基聯苯胺(DAB)染色,用蘇木精反染色,脫水和干燥后,用中性樹膠固定,使用倒置熒光顯微鏡(型號Ts2R, 日本尼康公司)拍照。免疫組織化學法染色結果的評估標準: 細胞質中出現棕色或棕黃色顆粒的細胞,或染色>25%的細胞為陽性細胞。采用平均陽性染色面積百分比法分析免疫組織化學法染色結果,實驗重復3次。

1.8 TUNEL實驗

將SN4741細胞置于共聚焦培養皿中,處理后,將細胞用4%多聚甲醛固定15 min, 用0.1% Triton X-100滲透15 min, 用TUNEL檢測緩沖液于27 ℃避光孵育1 h。用冰PBS(pH值7.4)洗滌后,將細胞用DAPI染色,使用激光共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)觀察。

1.9 免疫熒光實驗

采用免疫熒光法檢測SN4741細胞中TH、α-syn、Nrf2和NQO1的表達。將細胞用4%多聚甲醛固定30 min, 用PBS洗滌3次(5 min/次)。用0.3% Triton X100處理細胞15 min, 用5%牛血清白蛋白封閉細胞2 h, 孵育一抗TH(1∶500)、α-syn(1∶500)、Nrf2(1∶200)、NQO1(1∶500), 4 ℃孵育過夜。用PBS洗滌后,細胞與熒光偶聯抗體(1∶400)在室溫下孵育2 h。用PBS洗滌3次(5 min/次),然后用二氨基-2-苯林多爾(DAPI)洗滌5 min, 使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞。

1.10 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測白細胞介素(IL)-1β、IL-18表達

IL-1β、IL-18的ELISA試劑盒(ml043627、ml043547)購自上海酶聯生物科技有限公司。通過雙抗體夾心ELISA法檢測腦組織提取液和細胞培養液中IL-1β、IL-18蛋白表達水平,實驗步驟嚴格按照說明書進行。檢測各組樣本的450 nm處光密度(OD450 nm)值,根據標準曲線獲得各組樣本的IL-1β、IL-18表達量,同時設置空白對照孔。

1.11 統計學分析

所有數據以Graph PadPrism 7.0軟件進行分析,2組間比較采用t檢驗,多組間比較采用F檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠曠場實驗結果

曠場實驗結果顯示, MPTP組小鼠對場地中心的探索少于對照組, MPTP+紅景天苷(60 mg/kg)組小鼠的探索少于對照組但多于MPTP組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖1A; MPTP組小鼠3 min活動總距離和平均速度短于或低于對照組, MPTP+紅景天苷(40 mg/kg)組、MPTP+紅景天苷(60 mg/kg)組小鼠3 min活動總距離和平均速度均長于或高于MPTP組,但仍短于或低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖1B、圖1C。

A: 曠場實驗活動軌跡圖; B、C: 曠場內3 min總距離、平均速度(與對照組比較, ?P<0.05; 與MPTP組比較, #P<0.05)。圖1 各組小鼠的曠場實驗結果

2.2 紅景天苷對MPTP誘導PD小鼠TH、α-syn、Nrf2、NQO1、IL-1β、IL-18表達的影響

免疫組織化學法和ELISA檢測結果顯示,與對照組相比, MPTP組小鼠腦組織TH、Nrf2、ARE表達減少,α-syn、IL-1β、IL-18表達增加,差異有統計學意義(P<0.01); 與MPTP組相比, MPTP+紅景天苷(40 mg/kg)組、MPTP+紅景天苷(60 mg/kg)小鼠腦組織TH、Nrf2、NQO1表達增加,α-syn、IL-1β、IL-18表達減少,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01), 見圖2。

A: TH、α-syn、Nrf2、NQO1表達情況(免疫組化染色法,標尺20 μm); B、C: IL-1β、IL-18表達情況(與對照組比較, ??P<0.01; 與MPTP組比較, #P<0.05, ##P<0.01)。圖2 各組小鼠腦組織TH、α-syn、Nrf2、NQO1、IL-1β和 IL-18表達情況

2.3 紅景天苷對MPTP誘導SN4741細胞凋亡和IL-1β、IL-18表達的影響

TUNEL實驗結果顯示, MPTP組細胞凋亡相較對照組增加, MPTP+紅景天苷(10 μmol/L)組、MPTP+紅景天苷(50 μmol/L)組細胞凋亡少于MPTP組但多于對照組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖3A。

ELISA檢測結果顯示, MPTP組細胞IL-1β、IL-18表達相較對照組增加, MPTP+紅景天苷(10 μmol/L)組、MPTP+紅景天苷(50 μmol/L)組細胞IL-1β、IL-18表達均少于MPTP組,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01), 見圖3B、圖3C。

A: 細胞凋亡情況(TUNEL染色法,標尺20 μm); B: IL-1β、IL-18表達(與對照組比較, ??P<0.01; 與MPTP組比較, #P<0.05, ##P<0.01)。圖3 各組SN4741細胞TUNEL實驗結果和ELISA實驗結果

2.4 紅景天苷對MPTP誘導SN4741細胞TH、α-syn、Nrf2、NQO1表達的影響

免疫熒光實驗結果顯示,與對照組相比, MPTP組細胞TH、Nrf2、NQO1表達減少,α-syn表達增加,差異有統計學意義(P<0.05); 與MPTP組相比,紅景天苷(10 μmol/L)組、紅景天苷(50 μmol/L)組細胞TH、Nrf2、NQO1表達增加,α-syn表達減少,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4。

2.5 紅景天苷通過Nrf2-ARE信號通路改善MPTP誘導SN4741細胞的凋亡情況

qRT-PCR實驗結果顯示, si-Nrf2組Nrf2mRNA表達低于對照組和si-NC組,差異有統計學意義(P<0.01), 見圖5A; si-NQO1組NQO1mRNA表達低于對照組和si-NC組,差異有統計學意義(P<0.01), 見圖5B。

免疫熒光實驗結果顯示,分別阻斷Nrf2、NQO1表達后, MPTP組細胞凋亡多于對照組,差異有統計學意義(P<0.05); MPTP+紅景天苷(50 μmol/L)組細胞凋亡多于對照組,差異有統計學意義(P<0.05), 與MPTP組差異無統計學意義(P>0.05), 見圖5C、圖5D。

A: TH; B: NQO1; C: Nrf2; D: α-syn。圖4 各組SN4741細胞TH、α-syn、Nrf2和NQO1的表達(免疫熒光染色法)

A、B: qRT-PCR實驗結果(與對照組比較, ?P<0.05, ??P<0.01; 與si-NC組比較,##P<0.01); C、D: 免疫熒光實驗結果(免疫熒光染色法)。圖5 各組SN4741細胞Nrf2、NQO1表達情況

3 討 論

紅景天苷具有多種藥理活性,在體外和體內都表現出抗炎和抗氧化作用[8]。PD是一種常見的年齡相關的神經退行性疾病,典型特征是多巴胺能神經元缺失[9]。PD患者的神經元數量逐漸減少,其中至少80%的紋狀體神經元發生丟失[10]。MPTP是一種神經元選擇性毒素,可以穿越血腦屏障,并在星形膠質細胞和5-羥色胺能神經元內的單胺氧化酶B作用下轉變為強毒性的1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP1), 釋放到細胞外。MPP1無法穿越血腦屏障,而是經多巴胺轉運體進入多巴胺能神經末梢和胞體,選擇性破壞黑質多巴胺能神經元,進而誘發PD癥狀[11]。SN4741細胞為小鼠多巴胺能神經細胞系,已被廣泛用作體外PD模型。本研究以MPTP誘導的多巴胺能神經元丟失C57BL/6小鼠和MPTP誘導的SN4741細胞作為PD的體內外實驗模型,結果表明,紅景天苷能有效改善MPTP誘導的行為障礙。TH是多巴胺能生物合成中的一種限速酶,與PD的發生發展密切相關[12]。本研究表明, MPTP處理的小鼠TH陽性神經元減少,而紅景天苷可以增加腦黑質和紋狀體中的TH陽性細胞。蛋白質降解缺陷在神經退行性病理過程中亦很常見, α-syn的過度積累是PD的另一個典型病理特征。研究[13]表明, α-syn聚集物可能通過小膠質細胞的內吞作用激活NLRP3炎癥小體,參與PD的發病機制。本研究結果顯示,紅景天苷處理可顯著減少α-syn在體內和體外的積累,表明紅景天苷可能是一種很有前途的PD治療藥物。雖然PD的確切發病機制尚不明確,但既往研究已證實炎癥、氧化應激在PD的發生發展中起著關鍵作用,例如炎癥因子IL-1β、IL-18。本研究結果顯示,紅景天苷在體內和體外均可顯著抑制MPTP誘導的IL-1β、IL-18水平升高。

Nrf2是一種轉錄因子,在穩態條件下通過與Kelch樣ECH相關蛋白1(KEAP1)結合而在大多數組織和細胞的細胞質中低水平表達[14]。Nrf2響應 KEAP1感知的應激信號而釋放,易位到細胞核,積累并與靶基因啟動子的ARE結合,進而啟動受ARE調控的NQO1等基因的轉錄,以保護細胞免受氧化應激引起的損傷并維持氧化還原穩態[15]。研究[16]表明, Nrf2-ARE信號通路在PD進展過程中發揮重要作用。本研究結果顯示,紅景天苷在體內外均顯著激活了Nrf2-ARE信號通路,這可能是紅景天苷減輕PD的作用靶點。為了進一步探討紅景天苷對PD的治療作用與Nrf2-ARE信號通路之間的關系,本研究以siRNA阻斷Nrf2在SN4741細胞中的表達,發現紅景天苷對MPTP誘導SN4741細胞凋亡的保護作用消失,提示紅景天苷很可能通過Nrf2-ARE信號通路發揮減輕PD的作用。

綜上所述,紅景天苷對PD具有治療作用,其可能通過Nrf2-ARE信號通路而減輕神經元細胞凋亡情況,有望成為一種新的PD治療藥物。