刺五加精制多糖對尼古丁誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠的影響

鄒 婷, 劉友昊, 高曉巖, 鄧代千, 吳宜艷

(1. 牡丹江醫(yī)學(xué)院, 黑龍江 牡丹江, 157011; 2. 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院, 黑龍江 牡丹江, 157011)

尼古丁主要作用于中樞系統(tǒng),是導(dǎo)致機(jī)體對煙草上癮和產(chǎn)生依賴的重要物質(zhì)。尼古丁依賴是由反復(fù)吸煙導(dǎo)致的慢性、有強(qiáng)烈成癮、易復(fù)發(fā)的一種征候群,具備顯著的戒斷癥狀[1-2]。尼古丁戒斷綜合征是指當(dāng)機(jī)體反復(fù)攝入尼古丁形成尼古丁依賴后,終止給藥后會(huì)產(chǎn)生一系列軀體、認(rèn)知和情感障礙[3],危害身心健康。認(rèn)知障礙包括難以集中注意力和記憶力退化[4],是尼古丁戒斷癥狀的核心癥狀。研究[5]證明,尼古丁依賴可導(dǎo)致海馬相關(guān)認(rèn)知功能受損,因此改善尼古丁戒斷個(gè)體的學(xué)習(xí)與記憶能力,可能是改善尼古丁戒斷綜合征的有效途徑。刺五加多糖是中藥刺五加的主要活性成分之一,具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞等作用。研究[6]表明,純化刺五加水溶性多糖具有高效的體外抗氧化及體外淋巴細(xì)胞增殖的免疫調(diào)節(jié)活性。實(shí)驗(yàn)[7]結(jié)果表明,刺五加多糖可改善小鼠腦組織中自由基引起的氧化損傷,從而提高輻射誘導(dǎo)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。關(guān)于刺五加多糖對尼古丁誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙報(bào)道罕見,本研究采用刺五加精制多糖(ASPS)干預(yù)治療該病,從海馬相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)及機(jī)體抗氧化角度分析其作用機(jī)制,以期為臨床尼古丁戒斷癥狀尋找新的藥物。

1 材料與方法

1.1 藥物

尼古丁購于上海時(shí)代生物科技有限公司; 吡拉西坦購于廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司; 刺五加浸膏購于黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取6周齡無特殊病原體(SPF)級美國癌癥研究所(ICR)小鼠96只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2) g, 購買于牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心[SCXK(黑)2019-006], 福利與倫理審查編號: IACUC-20221021-2。動(dòng)物房溫度控制在20～24 ℃, 飼養(yǎng)期間自由飲水、進(jìn)食。

1.3 主要儀器與試劑

Morris水迷宮、新物體識(shí)別設(shè)備(上海欣軟信息科技有限公司); 超氧化物歧化酶(SOD)、五羥色胺(5-HT)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 ASPS的制備

稱取刺五加浸膏200 g, 加水至2 000 mL溶解,經(jīng)醇沉、sevage-木瓜蛋白酶法脫蛋白、醇沉、活性炭粉末脫色素、濃縮、凍干,得刺五加粗多糖,再經(jīng)纖維素柱層析純化、透析、濃縮、凍干獲得ASPS,苯酚-硫酸法測葡萄糖含量為94.31%。

1.5 動(dòng)物分組與給藥

96只小鼠分2批進(jìn)行試驗(yàn),即水迷宮試驗(yàn)和新物體試驗(yàn)。每批48只,隨機(jī)分為6組,每組8只,分別為空白組、模型組、陽性藥物組、ASPS高劑量組(270 mg/kg)、ASPS中劑量組(90 mg/kg)、ASPS低劑量組(30 mg/kg)。除空白組外,其余5組連續(xù)7 d, 每天皮下注射尼古丁0.5 mg/kg, 制備尼古丁記憶障礙模型。第7天注射尼古丁24 h后,陽性藥物組灌胃吡拉西坦800 mg/kg, ASPS高劑量組、中劑量組、低劑量組分別灌胃ASPS 270、90、30 mg/kg, 連續(xù)灌胃7 d。水迷宮試驗(yàn)從第9天開始,給藥2 h后,進(jìn)行水迷宮適應(yīng)性游泳2 min, 第10～13天連續(xù)4 d給藥2 h后進(jìn)行水迷宮定位航行試驗(yàn),第14天給藥2 h后進(jìn)行水迷宮空間搜索試驗(yàn)。新物體識(shí)別試驗(yàn),從第13天給藥2 h后進(jìn)行新物體識(shí)別的適應(yīng)階段10 min; 第14天給藥2 h后進(jìn)行新物體識(shí)別試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)束動(dòng)物立即處死,取材。

1.6 Morris水迷宮試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前1 d讓小鼠自由游泳2 min適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠面向池壁除目標(biāo)象限(Ⅲ象限)之外的3個(gè)象限分別放入水中1次,記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期,連續(xù)4 d重復(fù)此步驟。第5天先將小鼠在平臺(tái)上放置30 s, 撤去平臺(tái),從目標(biāo)象限對側(cè)象限(Ⅰ象限)將小鼠放入水中,時(shí)間設(shè)定為90 s。用super Maze視頻采集系統(tǒng)記錄每只小鼠潛伏期, Ⅲ象限路程比例、平臺(tái)穿越次數(shù)、平均速度等。

1.7 新物體識(shí)別試驗(yàn)

新物體識(shí)別試驗(yàn)分為適應(yīng)、熟悉和測試3個(gè)階段。前1 d將小鼠放置于裝置中適應(yīng)10 min。第2天熟悉期的習(xí)得階段, 2個(gè)幾乎相同的物體分別放置在箱子一側(cè)的2個(gè)角落,小鼠自由探索10 min; 間隔2 h后進(jìn)行測試階段10 min, 將其中1個(gè)舊物體更換為大小與舊物體相似,但形狀、顏色均不同的新物體,以確定小鼠的目標(biāo)記憶能力。用super Maze 軟件記錄小鼠頭部探索舊物體和新物體的次數(shù)和時(shí)間,計(jì)算辨別指數(shù)。

1.8 血清SOD活性和海馬組織5-HT含量測定

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠眼球取血,靜置2 h后, 3 000轉(zhuǎn)/min離心30 min, 取上清,測試血清SOD活性,具體實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

取血后小鼠立即斷頭處死,冰上取腦,分離出海馬組織,稱重。按重量體積比1 g∶9 mL加入9倍體積的PBS(pH值 7.4), 勻漿機(jī)粉碎, 3 000轉(zhuǎn)/min離心20 min, 收集上清,備用。Elise法測定小鼠海馬組織中5-HT的含量,具體實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行處理,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA), 組間比較采用LSD法,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ASPS對小鼠短期記憶能力障礙的影響

與空白組比較,模型組小鼠的辨別指數(shù)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與模型組比較,陽性藥物組及ASPS高、中、低劑量組小鼠的辨別指數(shù)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果表明, ASPS和陽性藥物吡拉西坦均能顯著減輕尼古丁戒斷引起的短期記憶能力障礙,見表1。

表1 ASPS對各組小鼠短期記憶能力障礙的影響

2.2 ASPS對小鼠長期學(xué)習(xí)記憶能力障礙的影響

與空白組比較,模型組小鼠的逃避潛伏期延長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明成功建立了尼古丁戒斷記憶障礙模型。與模型組比較,陽性藥物組的逃避潛伏期縮短,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 與模型組比較, ASPS高、中劑量組的逃避潛伏期縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較,模型組小鼠的平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)、平均速度、Ⅲ象限路程比例降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與模型組比較,陽性藥物組小鼠的平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)、平均速度及Ⅲ象限路程比例均增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 而ASPS高劑量組小鼠的平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)、平均速度增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), ASPS高、中劑量組小鼠的Ⅲ象限路程比例增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,陽性藥物吡拉西坦不能顯著減輕由尼古丁戒斷引起的長期學(xué)習(xí)記憶能力障礙,而ASPS能顯著減輕長期學(xué)習(xí)記憶能力障礙,見表2。

表2 ASPS對各組小鼠長期學(xué)習(xí)記憶能力障礙的影響

2.3 ASPS對各組小鼠血清中SOD活性、海馬組織5-HT含量的影響

與空白組比較,模型組小鼠血清SOD活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 與模型組比較,陽性藥物組和ASPS高、中、低劑量組小鼠血清SOD活性增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與空白組比較,模型組小鼠海馬組織中5-HT含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與模型組比較,ASPS高、中劑量組小鼠海馬組織的5-HT含量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05), 見表3。

表3 ASPS對各組小鼠血清SOD活性、海馬組織中5-HT含量的影響

3 討 論

中國2018年開展的第6次全國吸煙流行病學(xué)調(diào)查[8]顯示,大于15歲的吸煙人數(shù)達(dá)3.08億, 原來越多的人深陷吸煙的困境,吸煙嚴(yán)重危害健康是不爭的事實(shí)。戒煙不僅會(huì)引發(fā)生理、情感等戒斷癥狀,還會(huì)造成認(rèn)知功能障礙,影響學(xué)習(xí)記憶水平。

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)過程分為適應(yīng)期、熟悉期及測試期,主要用于嚙齒類動(dòng)物非空間、短期對物體辨別記憶能力的檢測[9]。本研究發(fā)現(xiàn),尼古丁戒斷模型小鼠的辨別指數(shù)顯著降低,表明尼古丁戒斷小鼠新物體識(shí)別能力受損; ASPS治療后小鼠的辨別指數(shù)顯著增加,表明ASPS在一定程度上可以改善尼古丁戒斷小鼠的辨別記憶能力。Morris水迷宮試驗(yàn)是用于檢測嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典試驗(yàn),主要包含定位航行試驗(yàn)和空間搜索試驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn),尼古丁戒斷模型小鼠平均速度顯著降低,表明其身體健康狀況明顯弱于正常健康小鼠; 此外逃避潛伏期明顯延長,平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)和Ⅲ象限路程比例明顯降低,表明尼古丁戒斷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力水平明顯下降。經(jīng)ASPS治療后小鼠的逃避潛伏期顯著縮短, Ⅲ象限路程比例、平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)和平均速度顯著增加,表明ASPS可明顯提高尼古丁戒斷小鼠的身體健康狀況和改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力水平。

造成學(xué)習(xí)記憶能力減退的因素眾多,主要包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能減退等方面[10]。海馬中存在大量與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì),如單胺類去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-HT, 膽堿類乙酰膽堿等[11]。5-HT又稱血清素,在大腦皮層及神經(jīng)突觸中含量很高,參與精神、情緒、記憶等方面的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn),尼古丁戒斷模型小鼠海馬組織的5-HT含量明顯降低,表明尼古丁戒斷可能引起海馬區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平降低; 經(jīng)ASPS高、中劑量治療后,小鼠海馬區(qū)5-HT含量明顯增加,表明ASPS可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平來改善尼古丁戒斷誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙。

氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面反應(yīng),機(jī)體抗氧化能力下降、自由基堆積會(huì)造成神經(jīng)細(xì)胞毒性,影響學(xué)習(xí)記憶功能。SOD是體內(nèi)一種抗氧化酶[12], SOD活性越低,表明機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷越嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn), ASPS治療后尼古丁戒斷誘導(dǎo)的模型小鼠血清SOD活性增加,表明抗氧化應(yīng)激是ASPS改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙的潛在機(jī)制。

綜上所述, ASPS可以有效改善尼古丁戒斷誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶能力障礙,該作用與調(diào)節(jié)胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平、抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。