核酸適配體熒光探針法和液基夾層杯法檢測結核分枝桿菌臨床應用價值比較

徐镠粵 廖慶華 彭柯皓 余美玲 陳燕梅 卓文基 賴曉宇

（廣東省結核病控制中心，廣東 廣州 610630）

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染病，嚴重危害公共健康，患者除頭發、指甲外，全身各個器官和系統均可受累，以肺部感染為主。據《全球結核病報告》[1]顯示，2020年全球新發結核病病例987萬例，較往年有所緩解；我國作為結核病高負擔國家之一，僅次于印度，發病例數居全球第二位（8.5%），原因主要是新型結核病診斷技術的開發與應用進度緩慢，新型抗結核藥物匱乏。目前，結核病的微生物學診斷方法有抗酸染色鏡檢、MTB分離培養和體外藥物敏感性試驗等，其中抗酸染色鏡檢是我國基層結核病實驗室診斷結核病的重要方法，也是較為經濟的選擇，但其影響因素較多，敏感性較差，部分感染患者不能被及時發現。因此，開發快速、準確、簡便、低成本的結核病實驗室診斷方法非常重要。

核酸適配體是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA），是從1個體外合成的隨機寡核苷酸文庫中，通過指數富集的配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選到的與靶物質特異性結合的一簇小分子單鏈DNA或RNA片段[2]。適配體具有可體外人工合成、高特異性、高親和力、高敏感性，以及作用的靶分子范圍極廣等特點[3]。本研究中的核酸適配體熒光探針法是廣東省結核病控制中心和有關企業共同研發的一種新的MTB鏡檢方法，目前尚處于實驗階段。液基夾層杯法與傳統的抗酸染色鏡檢法最大的區別在于具有消化富集特點，能夠有效提高檢出率[4]。本研究擬評估液基夾層杯法和核酸適配體熒光探針法在臨床診斷結核病中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2 0 2 1年3-5月東莞市第六人民醫院175例臨床確診為肺結核的住院患者（肺結核組），其中男1 0 3 例、女7 2 例，年齡（43.6±10.3）歲。另選取80名健康體檢者為對照組，其中男46名、女34名，年齡（40.8±9.6）歲。留取所有研究對象3份痰液樣本（清晨痰、即時痰和夜間痰，均為用藥前留取），將3份痰液樣本混勻后，分別用液體培養法、固體培養法、抗酸染色鏡檢法、液基夾層杯法和核酸適配體熒光探針法進行檢測。肺結核診斷符合《肺結核診斷標準（WS288-2017）》要求[5]。排除標準：1）長期接受糖皮質激素或免疫抑制劑治療；2）伴心臟、肝臟、腎臟疾病；3）惡性腫瘤患者。本研究經廣東省結核病控制中心倫理委員會批準（20211129），所有受試者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 液體培養法

將痰液樣本用NALC-NaOH混合溶液（批號C12157777，上海麥克林生化科技有限公司）消化離心后，棄上清，用磷酸鹽緩沖液（批號112520210408，上海碧云天生物技術有限公司）重懸，加入含有MGIT PANTA和MGIT生長添加劑（批號1042610，美國BD公司）的培養管中，使用BACTECTM MGIT 960液體培養系統（美國BD公司）進行培養。培養陽性結果系統直接報告；培養陰性，42 d（6周）后報告結果。

1.2.2 固體培養法

將痰液樣本用4%氫氧化鈉消化15 min，接種于羅氏固體培養基（批號20211122，珠海貝索生物技術有限公司），于37 ℃溫箱中孵育，持續觀察菌株生長情況，如56 d（8周）后培養基無菌落生長，則報告為陰性。

1.2.3 液基夾層杯法

將痰液樣本用消化液（批號201201，湖南天騎醫學新技術股份有限公司）充分混勻后放置30～60 min，至消化完全。取2 mL消化好的樣本，加入已預熱濕膜后的夾層杯中，使用痰自動涂片染色機（湖南天騎醫學新技術股份有限公司）進行抗酸染色，烘干，油鏡下觀察。

1.2.4 核酸適配體熒光探針法

將痰液樣本用4%氫氧化鈉消化15 min，加入蛋白酶K溶液，酶解后離心去上清，加入核酸適配體熒光探針，磷酸鹽緩沖液溫和振蕩孵育后離心去上清，用磷酸鹽緩沖液重懸，涂片鏡檢。MTB鏡下呈現桿狀綠色熒光（圖1）。

圖1 核酸適配體熒光探針法陽性涂片

1.2.5 抗酸染色鏡檢法

將痰液樣本直接涂布于載玻片上，用抗酸染色液（批號C210401，珠海貝索生物技術有限公司）進行染色，自然干燥，油鏡下觀察。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。采用Kappa一致性檢驗進行一致性分析，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，R O C）曲線評價核酸適配體熒光探針法診斷肺結核的效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺結核組和對照組5種方法檢測結果

對照組中，抗酸染色鏡檢法和核酸適配體熒光探針法分別檢出1例和3例陽性，其他方法均為陰性。5種方法檢測結果見表1。

表1 肺結核組和對照組5種方法檢測結果 例

2.2 核酸適配體熒光探針法診斷價值

以液體培養法為參考標準，核酸適配體熒光探針法的敏感性為54.79%、特異性為50.98%、準確度為52.57%、陽性預測值為44.44%、陰性預測值為61.68%。一致性分析結果顯示，核酸適配體熒光探針法與液體培養法、抗酸染色鏡檢法一致性較差（P＞0.05）；見表2、表3。ROC曲線分析結果顯示，以液體培養法為參考，核酸適配體熒光探針法診斷肺結核的曲線下面積為0.529，95%可信區間為0.442～0.616，P=0.515；以抗酸染色鏡檢法為參考，核酸適配體熒光探針法診斷肺結核的曲線下面積為0.506，95%可信區間為0.420～0.591，P=0.899。

表2 核酸適配體熒光探針法與液體培養法比較 例

表3 核酸適配體熒光探針法與抗酸染色鏡檢法比較例

2.3 液基夾層杯法診斷價值

以液體培養法結果為參考，液基夾層杯法的敏感性為78.08%、特異性為98.04%、準確度為89.71%、陽性預測值為96.61%、陰性預測值為86.21%。一致性分析結果顯示，液基夾層杯法與液體培養法、抗酸染色鏡檢法一致性較好（P＜0.001）。見表4、表5。

表4 液基夾層杯法與液體培養法比較 例

表5 液基夾層杯法與抗酸染色鏡檢法比較 例

ROC曲線分析結果顯示，以液體培養法為參考，液基夾層杯法診斷肺結核的曲線下面積為0.881，95%可信區間為0.821～0.940，P＜0.001；以抗酸染色鏡檢法為參考，液基夾層杯法斷肺結核的曲線下面積為0.792，95%可信區間為0.711～0.874，P＜0.001。

3 討論

結核病是全球十大致死性疾病之一，盡管不斷有新的診斷方法、藥物和疫苗被開發出來，但結核病仍是威脅人類健康的全球性公共衛生問題。結核病的檢測方法很多，痰涂片抗酸染色鏡檢簡單、快速、經濟，是最常用的方法，特別是在欠發達地區[6]；培養法作為公認的診斷結核病的病原學金標準，具有高敏感性和特異性，但耗時較長[7]；液基夾層杯法是國家科技重大專項成果，作為結核病診斷的新技術，具有生物安全性高和陽性檢出率高的特點[4]；近年來，國內外關于適配體的研究發展迅速，已成功篩選到多種MTB適配體用于結核病的診斷和鑒別，其檢測敏感性和特異性明顯高于傳統方法[2]。有研究發現，液體培養法和固體培養法陽性率差異無統計學意義（P＞0.05），但固體培養法操作簡單，成本低，可以直接判斷是否存在污染，更適合基層實驗室開展；液體培養法則更為快速、準確[8]。基于此，本研究以液體培養法為參考，比較液基夾層杯法和核酸適配體熒光探針法的一致性。借鑒培養法對樣本的消化預處理是液基夾層杯技術的主要創新點，結合充分震蕩，使痰液樣本完全液化，有利于抗酸桿菌在特殊底膜上沉淀，然后染色讀片。該技術相較于傳統涂片染色，陽性率有極大的提高[9]，并有效避免了生物安全風險。本研究發現，液基夾層杯法敏感性、特異性、準確度、陽性預測值和陰性預測值與已有研究結果[10]一致，各項指標優于抗酸染色鏡檢法，且液基夾層杯法與液體培養法一致性較好。本研究有2例液基夾層杯法陽性、液體培養法陰性的樣本，可能與患者服用過抗結核藥物有關。抗結核藥物治療后，患者體內MTB活性降低，排菌減少，從而可能導致結果出現涂片陽性、培養陰性[11]。

適配體是單鏈DNA或RNA寡核苷酸，能夠與靶分子結合，具有很高的特異性和親和力，因此，適配體被用于診斷、生物傳感器和靶向治療，被認為是酶聯免疫吸附試驗中抗體的替代品[12]。目前已研發出多種應用于MTB診斷的適配體，如分泌蛋白MPT64、CFP-10、ESAT6，作為靶物質的適配體，在MTB診斷上均有重大突破[2]。本研究采用了一種新型適配體技術--核酸適配體熒光探針法檢測MTB，結果顯示，以液體培養法為參考，核酸適配體熒光探針法敏感性為54.79%，這與成熟的液基夾層杯法和培養法的結果有較大差異；在陰性對照組中，有3例被判斷為陽性；經Kappa一致性分析和ROC曲線分析，發現核酸適配體熒光探針法與液體培養法、抗酸染色鏡檢法的一致性均較差。有研究發現，在篩選核酸適配體的過程中，一些適配體的結合可能會因競爭相同的結合位點而被其他抗體抑制；另外，空間位阻和核苷酸長度等也會影響適配體的親和力，這可能是該方法診斷價值不高的原因之一[13]。基于核酸適配體的優化，可以通過位點序列的優化或從動力學上改善核酸適配體，從而提高其診斷MTB感染的價值[14]。

本研究樣本量較少，結論具有一定局限性，需要進一步研究結果加以驗證。

綜上所述，液基夾層杯法在結核病診斷中的價值較高，核酸適配體熒光探針技術尚需進一步優化。