L- 肉堿對海水小球藻葉綠素及鐵、鎂元素含量的影響

◆作者：邵盛男 張志超 鄒京京 陳玉珂 穆道運

◆單位：1.中國水產科學研究院東海水產研究所；2.吉林農業大學動物科學技術學院

海 水 小 球 藻（marine Chlorella sp.）是綠藻門（Chlorophyta）小球藻屬（Chtorella）的普生性單細胞綠色微藻，呈球形或橢球形，其細胞內富含脂質、蛋白質、色素等營養物質。由于小球藻具有的生物活性和抗氧化性，其廣泛應用于養殖、食品、醫藥、紡織等領域。

L- 肉堿（L-carnitine）又稱維生素Bt，學名β-羥基γ-三甲銨丁酸，是由賴氨酸和蛋氨酸作為前體物質合成的一種類氨基酸。L- 肉堿廣泛存在于動植物中，其中在動物體內L- 肉堿可通過日糧途徑及內源合成獲得，植物組織中含量普遍低于動物組織，研究表明，L- 肉堿也存在于生物餌料中，但相對含量較低（Dong MZ 等，2006）。L- 肉堿可促進長鏈脂肪酸進入線粒體進行β- 氧化，以及清除線粒體中多余的短鏈和中鏈脂肪酰基CoA。同時它還具有提高抗氧化能力、增強免疫、促進幼體發育等作用（Kolodziejczyk J 等，2011）。

本研究在前人相關研究基礎上，探究不同濃度L- 肉堿對小球藻促生長的作用機理。旨在為L- 肉堿在微藻培養以及應用領域提供參考，同時為天然色素生產技術提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

海水小球藻由中國海洋大學藻種庫提供。試驗所用試劑：L- 肉堿購自Sigma 公司（產品代號c-0158）；鎂單元素標準溶液（GSB 04-1735-2004）、鐵單元素標準溶液（GSB 04-1726-2004）購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；濃硝酸、N,N- 二甲基甲酰胺、人工基礎海水及f/2培養基所用試劑均為分析純；試驗用水均為蒸餾水。

1.2 主要儀器與設備

光照培養箱（HPG-400BX）、冷凍高速離心機（HITACHI CR21N）、全功能微孔板檢測儀（Biotek Synergy H1）、原子吸收光譜儀（Agilent 3510）、電子分析天平（BSA124S-CW）、超聲波清洗儀（Auto Science AS）、超凈工作臺（SW-CJ-2FD）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

接種前對試驗用具及培養基進行滅菌處理。采用f/2 培養基及人工基礎海水作為營養源，接種后待培養體系穩定后分別添加濃度0、5、50、100、200 mg/L的L- 肉堿。在光照培養箱恒溫條件下，溫度25±1 ℃，光照強度4000 lx，光暗比24 h∶0 h，2 L培養體積，培養10d，試驗期結束后使用冷凍高速離心機收集海水小球藻樣品，-80 ℃保存備用。

試驗人工基礎海水成分和選用f/2 培養基見表1 和表2。

1.3.2 葉綠素含量的測定

試驗結束后，每組取20 mL藻液4 ℃條件10000 r/min 離心10 min，去除上清，加入5 mL 的N,N- 二甲基甲酰胺于收獲的藻樣品中，重新懸浮后，置于黑暗條件下4 ℃浸提24 h。樣品5000 r/min 離心10 min。測定樣品及空白樣品647 nm 和664.5 nm 處OD 值（Chen X 等，2016）。

1.3.3 鐵、鎂含量的測定

1.3.3.1 樣品處理及測定

稱取適量藻泥于坩堝65 ℃烘干至恒重，重新稱重統一每組干燥的藻細胞重量，碳化至無煙后，550 ℃灰化完全后，待溫度降低取出，加入1 體積濃硝酸與1體積水配制成的溶液5 mL 溶解沉淀，重復2 次將沉淀完全洗入容量瓶，蒸餾水定容至100 mL待測，調節Agilent 3510 型原子吸收光譜儀至最佳狀態，載氣為乙炔，設置鐵、鎂空心陰極燈在248.3 nm、285.2 nm 波長處檢測元素濃度。

1.3.3.2 標準曲線制作

將1000μg/mL 的鐵、鎂標準溶液，使用蒸餾水配置成標準系列溶液，鐵為：0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL；鎂為0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6μg/mL。測定方法保持與樣品一致，得出回歸方程和相關系數，見表3。

表3 金屬元素回歸方程及相關

1.4 統計分析

采用方差分析法比較試驗所得數據。應用Tukey 多重比較檢驗比較各處理組間均值的差異顯著性，差異顯著性水平P值設在0.05。數據均采用SPSS 20.0 軟件進行分析，GraphPad Prism 5.0 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 L- 肉堿對海水小球藻葉綠素含量的影響

圖1 所示，在一定濃度范圍內，葉綠素a 含量隨L- 肉堿濃度先增加后降低，5 mg/L 肉堿組海水小球藻葉綠素a 含量顯著高于對照組及其他處理組（P＜0.05），100 mg/L 肉堿組中海水小球藻葉綠素a 含量顯著低于5 mg/L 以及50 mg/L 肉堿組（P＜0.05），200 mg/L 肉堿組中海水小球藻葉綠素a 含量高于100 mg/L 肉堿組，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 L- 肉堿對海水小球藻葉綠素a 含量的影響

圖2 所示，在一定濃度范圍內葉綠素b 含量隨L- 肉堿濃度先增高后降低，總體趨勢與葉綠素a 含量相似，5 mg/L 肉堿組海水小球藻葉綠素b 含量顯著高于對照組及其他處理組（P＜0.05），100 mg/L 肉堿組中海水小球藻葉綠素b 含量顯著低于5 mg/L 以及50 mg/L 肉堿組（P＜0.05），海水小球藻中葉綠素b 含量要低于葉綠素a 含量。

圖3 所示，在一定濃度范圍內總葉綠素含量隨L- 肉堿濃度先增高后降低，5 mg/L 肉堿組中海水小球藻總葉綠素含量最高，100 mg/L 肉堿組中海水小球藻總葉綠素含量最低，在5～100 mg/L 的L- 肉堿濃度范圍內總葉綠素含量隨肉堿濃度增高而降低，200 mg/L 肉堿組總葉綠素含量高于100 mg/L 肉堿組，但差異不顯著（P＞0.05），且略低于對照組。

圖3 L- 肉堿對海水小球藻總葉綠素含量的影響

2.2 L- 肉堿對海水小球藻金屬元素鐵、鎂含量的影響

圖4 所示，在5～100mg/L范圍內，金屬元素鐵的含量隨著L- 肉堿添加濃度的增加而減少，5、50、100、200 mg/L 組 間 鐵含量差異顯著（P＜0.05），其中5、50 mg/L 肉堿組鐵含量顯著高于對照組，兩組間差異顯著，100 mg/L 肉堿組鐵含量高于對照組但 無 顯 著 差 異（P＞0.05），200 mg/L 肉堿組鐵含量顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖5 所示，在5～100mg/L范圍內，海水小球藻中鎂元素含量隨著L- 肉堿添加量的增加而減少。5 mg/L 肉堿組海水小球藻中鎂元素含量顯著高于對照組和200 mg/L 肉堿組（P＜0.05），其中5 mg/L 肉 堿 組 與50 mg/L、100 mg/L 肉堿組之間無顯著差異（P＞0.05），200 mg/L 肉堿組鎂含量低于對照組但無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 L- 肉堿對海水小球藻鎂元素含量的影響

3 討論

3.1 小球藻在水產養殖業中的應用

小球藻在水產養殖業中的應用十分廣泛。首先，小球藻含有天然免疫物質和促生長物質，可以提高生產性能和機體免疫力，降低飼料消耗（Dalmo,R 等，1996），是我國水產養殖業廣泛使用的優良餌料藻及飼料添加劑。蔡榮等（2017）研究表明，飼料中添加小球藻醇提物對于提高花鱸的生產性能、改善體組成有一定的作用。何亞丁等（2014）研究發現，小球藻藻渣可以部分替代凡納濱對蝦飼料中的豆粕，降低豆粕的用量，而不影響凡納濱對蝦的生長和氮排放，并降低磷排放。常洪淼（2022）研究發現，新型高蛋白小球藻替代魚粉沒有對虹鱒的生長、代謝和腸道健康造成明顯的負面影響，具備大比例替代虹鱒飼料中魚粉的潛力。其次，小球藻在水質調控方面也有良好效果，如在水產動物養殖系統中，小球藻對于維持水體生態系統的正常功能以及水環境的穩定具有重要作用（王崇明等，1993）。在對凡納濱對蝦（宋楚兒等，2023）以及羅非魚（秦璐等，2021）的養殖尾水投放一定濃度的小球藻進行水質凈化實驗后發現，其對氨氮、磷酸鹽和硝酸鹽的去除效果較好，并可以調節水體微生物的群落結構，從而改善養殖水體水質狀況。此外，小球藻代謝可以合成多種色素，如葉綠素、葉黃素、蝦青素等，能起到改善水生動物體色，提高魚類肌肉質量，保護蝦蟹幼體發育等作用。并且由于小球藻所產生的是天然色素，因此還具有色價高、穩定性好、抗氧化性高以及安全健康的特征（蘇力德，2011）。有研究發現在飼料中添加適量的蝦青素能防止低密度脂蛋白氧化，并且對水生動物的生產無任何不利影響（Matsuno T 等，1990）。在飼料中添加一定的天然葉黃素也可以使水產動物呈現出靚麗鮮艷的自然健康顏色，同時還可以改善部分水產動物抗氧化指標以及生長性能（曾胡龍等，2021）。

培養高品質小球藻對水產養殖的意義十分重大，具有重要的應用前景。可以通過營養強化，調節藻色素組成來強化小球藻。同時提高小球藻運輸、保存的質量，以促進小球藻規模化生產（葛玲瑞等，2022）。

3.2 L- 肉堿在水產養殖業中的應用

L- 肉堿是一種具有多種生理功能和生物活性的新型無公害添加劑。對動物體來說，補充肉堿與補充其它維生素及礦物質具有同樣的重要性，目前肉堿的使用已受到普遍關注并廣泛應用于水產動物、豬、禽的養殖中。眾多研究表明，在養殖動物中添加適量的L- 肉堿可以提高動物飼料利用率和生產性能，改善肉品質，提高動物的抗病力。

在水產養殖中，L- 肉堿作為飼料添加劑對養殖動物的生長、脂代謝、抗氧化及免疫方面都發揮著重要作用。魚類方面，陳玉珂等（2012）研究表明，適宜質量濃度L- 肉堿強化的鹵蟲投喂草魚和鳙魚開口苗提高了魚苗體內多聚不飽和脂肪酸（PUFAs）的含量，這對促進魚開口苗生長有重要作用。然而也有部分研究表明，飼料中添加L- 肉堿對魚類生長、蛋白質利用率和飼料轉化率無明顯影響，如雜交條吻鱸、大菱鲆、黃顙魚、黑鯛、大口黑鱸、歐洲鱸和初始體重為（151.00±1.69）g 的虹鱒（于婷等，2019）。Sabzi 等（2017）研究表明，飼料中添加L- 肉堿能夠改善高脂飼料鯉魚幼魚體質并抑制脂質過氧化；許多研究也表明，在飼料中添加L- 肉堿能降低不同魚類的脂質含量并增加蛋白質含量，或降低組織和全身的蛋白質分解代謝，顯示出顯著的蛋白質儲留效果。明建華等（2013）研究發現，添加L- 肉堿可顯著提高青魚血清溶菌酶活性及補體C3 和C4 水平，從而增強魚體的非特異性免疫力。同時，L- 肉堿對甲殼類動物的生長和風味也具有促進作用，Sabrina 等（2009）研究發現，在沼蝦的飼料中添加L- 肉堿可以加速其脂肪酸的β氧化，促進對脂類的利用。吳成福等（2008）研究發現，添加L- 肉堿能提高斑節對蝦肌肉肌苷酸含量，增加對蝦鮮味作用，且低濃度肉堿的添加組效果更佳。

3.3 不同濃度L- 肉堿對海水小球藻葉綠素含量的影響

在小球藻細胞中，葉綠素鑲嵌在葉綠體的類囊體膜中，是其進行光合作用的重要物質，小球藻細胞中葉綠素主要由葉綠素a、葉綠素b 組成。在光合作用中，絕大部分葉綠素的作用是吸收及傳遞光能，但只有少數處于激發狀態的葉綠素a 可以將光能轉化為電能，葉綠素b 通過吸收光能輔助光合作用。對于人體，葉綠素具有輔助造血、提供維生素、維持酶活性、解毒等作用（張懷斌，2008）。

已有研究表明，L- 肉堿可以促進微藻種群增長。林偉杰（2016）研究表明L- 肉堿能夠提高海水小球藻對N、P 和Fe 營養鹽吸收率的同時增加小球藻葉綠素a 的含量，此次試驗結果表明不同濃度L- 肉堿對海水小球藻葉綠素含量均有影響。在一定的濃度范圍內，海水小球藻葉綠素含量隨L- 肉堿濃度呈現先升高后降低的趨勢。在L- 肉堿濃度為5 mg/L 時肉堿組海水小球藻葉綠素含量最高，顯著高于對照組及其他處理組（P＜0.05），100 mg/L 肉堿組中海水小球藻葉綠素含量最低，但與L- 肉堿濃度為200 mg/L 時相比差異不顯著（P＞0.05）。原因可能是由于L-肉堿屬于季銨鹽陽離子復合物，研究表明季銨鹽陽離子復合物能夠與某些細胞膜蛋白相互作用，改變其通透性，從而提高小球藻對N 等營養素的親和力（曾惠，2014），促進其對營養元素的吸收。因此，L- 肉堿能夠促進海水小球藻葉綠素含量很可能與其屬于季銨鹽陽離子復合物的屬性有關。另外，L- 肉堿的主要功能是參與脂類代謝，為機體供能，同時產生乙酰CoA，乙酰CoA又是藻類色素合成的前提物質，因此肉堿對海水小球藻葉綠素含量的影響也可能與L- 肉堿參與脂類代謝有關。

3.4 不同濃度L- 肉堿對海水小球藻金屬元素鐵、鎂含量的影響

在藻類的生長過程中，鎂由鎂螯合酶復合物催化Mg2+與原卟啉IX 結合，是葉綠素組成的重要金屬元素。鐵是葉綠素合成過程中關鍵酶的重要組成元素，在葉綠素合成過程中具有輔助催化的作用，同時在一定濃度范圍內鐵對藻類生長具有促進作用（丁飛飛，2010）。已有研究表明，L- 肉堿不僅能夠促進小球藻種群增長，還能提高金屬元素鐵等營養鹽的吸收（林偉杰，2017），本試驗結果表明不同濃度L- 肉堿對海水小球藻金屬元素鐵、鎂含量均有影響。海水小球藻金屬鐵、鎂含量隨著L- 肉堿濃度增高呈現先升高后逐漸降低的趨勢。在L- 肉堿濃度為5 mg/L 時肉堿組海水小球藻金屬鐵、鎂含量最高，其中金屬鐵含量顯著高于對照組及其他處理組（P＜0.05），而金屬鎂含量則顯著高于對照組并在一定程度上高于其他處理組；200 mg/L 肉堿組中海水小球藻金屬鐵、鎂含量最低，其中金屬鐵含量顯著低于對照組及其他處理組（P＜0.05），而金屬鎂含量則在一定程度上低于對照組及其他處理組（P＞0.05）。這表明L- 肉堿的加入能夠有效增加海水小球藻中金屬元素鐵、鎂的含量。這應該是由于藻類對鐵等營養元素的吸收是通過主動運輸，它們需要在藻細胞膜表面轉運蛋白的轉運作用以及相關酶的輔助下，才能被藻細胞吸收利用（鮑亦璐，2012）。目前已有關于L- 肉堿對動物細胞膜的研究表明，L- 肉堿可以保護細胞膜的完整性，對細胞膜有及時修復的功能，并減少對磷脂雙分子層的損害，能夠增加細胞膜的穩定性（王朕朕等，2012）。另外，L- 肉堿也可能通過提高藻細胞內脂肪酸β- 氧化，降低其膜脂質降解作用（周濤等，2006）。因此，L- 肉堿很可能是通過提高細胞膜穩定性從而提高海水小球藻對金屬元素的吸收。另外，海水小球藻中金屬元素鐵、鎂的含量有隨著L- 肉堿濃度增高而降低的趨勢，出現這種現象的原因可能是由于水體中的鐵鹽溶解度小，可利用率低，同時易與磷酸鹽生成沉淀。因此形成沉淀物導致海水小球藻中金屬元素鐵、鎂的含量減少。

本試驗條件下，5 mg/L 的L-肉堿能顯著提高海水小球藻中葉綠素含量及金屬元素鐵、鎂的含量。

參考文獻：（略）