短時受精結合早期補救ICSI的臨床應用價值分析

莫麗芬，阮秋燕，勞艷萍，王超，莫房德，鐘慧芝，牛向麗

(廣西壯族自治區生殖醫院,南寧 530029)

輔助生殖技術(ART)的蓬勃發展為不孕不育的患者帶來了福音,但仍無法避免常規體外受精(IVF)的患者有10%～15%存在受精失敗[1]。即使是常規卵胞漿內單精子注射(ICSI),也有1%～3%的患者受精失敗或受精低下[2]。大多數受精失敗歸因于精液質量太差或卵母細胞數量過少。在既往IVF周期中,授精后16～18 h觀察是否出現原核以判斷是否受精,若未出現原核,視為受精失敗,則立即進行補救ICSI(R-ICSI)。然而臨床研究顯示,對過夜受精失敗卵母細胞實施R-ICSI后,受精率仍較低,可能是由于卵母細胞老化或精子代謝產物毒性的影響[3]。臨床研究發現,卵母細胞在授精后4 h即出現第二極體[4]。在配子短期孵育4～6 h后去除顆粒細胞,可以早期發現受精率低或失敗,且不影響胚胎質量,故短時受精成為一種早期觀察受精率并及時采取干預措施的有效方法。2003年,首次報道對授精后6 h未出現第二極體的卵母細胞進行R-ICSI,其受精結局和妊娠結局均優于過夜補救,此后早期R-ICSI被廣泛應用于臨床[5]。早期R-ICSI不僅可避免卵母細胞老化,還可以減少精子代謝產物對卵母細胞的不良影響,保證胚胎發育與子宮內膜的同步性。大量研究報道,在授精4～6 h后剝除顆粒細胞觀察第二極體排出情況,對IVF受精失敗或受精率低于30%的卵母細胞行R-ICSI,可提高受精率,有效減少這部分患者因無可移植胚胎而取消周期,并改善妊娠結局[6-7]。本研究將R-ICSI組、常規IVF和ICSI組患者的相關資料進行比較,評估短時受精結合早期R-ICSI對胚胎發育和妊娠結局的影響,探討短時受精結合早期R-ICSI在IVF完全受精失敗和受精率低下周期中的臨床應用價值。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2020年1月至2021年12月于廣西壯族自治區生殖醫院接受ART助孕治療的患者臨床資料。

納入標準:(1)年齡20～35歲;(2)體質量指數(BMI)處于正常范圍(18.5～24.9 kg/m2);(3)激素水平均處于正常范圍,FSH(1～10 U/L)、LH(1～10 U/L)、E2(100～400 pmol/L);(4)促排卵方案為卵泡期長方案、黃體期長方案、超長方案和拮抗劑方案;(5)獲卵數≥5個;(6)第一次IVF/ICSI助孕;(7)選擇D3胚胎或D5囊胚進行移植。

排除標準:(1)排除使用供體卵子/精子、子宮異常、嚴重少精子癥;(2)排除有過IVF/ICSI治療史。(3)排除卵巢反應異常和子宮異常;(4)排除夫妻雙方某一方染色體異常。

根據納入排除標準,本研究共納入2 649個周期。根據最終的受精方式,分為短時受精結合早期R-ICSI組(R-ICSI組,105個周期)、常規IVF組(IVF組,2 058個周期)及常規ICSI組(ICSI組,486個周期)。其中,R-ICSI組新鮮移植周期有56個,IVF組新鮮移植周期有1 059個,ICSI組新鮮移植周期有259個。

二 研究方法

1.促排卵方案及取卵:所有患者采用卵泡期長方案、黃體期長方案、超長方案和拮抗劑方案等常規促排卵方案,至少3個卵泡平均直徑達到≥18 mm時,注射10 000 U注射用絨毛膜促性腺激素(HCG,珠海麗珠),36～40 h后經陰道B超穿刺取卵,獲得的卵母細胞轉移至受精培養液繼續培養。

2.精液處理和受精:男方禁欲3～5 d后,手淫取精,根據WHO標準對精子濃度、活率、形態進行評估,通過密度梯度離心聯合上游法處理精液,將精液密度調至1×106/ml。注射HCG約40 h后,根據男方精液情況選擇常規IVF和ICSI。

3.脫顆粒細胞與R-ICSI:IVF組在授精16～18 h后,脫顆粒細胞,觀察原核和第二極體,判斷受精情況。R-ICSI組在授精后4～6 h機械去除顆粒細胞,置于新的培養基中觀察是否出現第二極體。如果所有卵母細胞或超過30%的卵母細胞均未出現第二極體,將觀察時間延至授精后8～9 h,若仍未增加第二極體的數目則立即進行R-ICSI。

4.胚胎培養及評分:授精后的16～20 h觀察到2PN和2PB為正常受精。卵裂期胚胎(D3)評分采用Peter評分法,囊胚(D5/D6)形態學評分采用Gardner評分法[8]。選擇1～2枚優質胚胎進行移植。

三、統計學分析

結 果

一、患者的基本資料

3組患者的女方年齡、BMI、不孕年限、基礎生殖激素(E2、FSH、LH)水平、Gn用量和天數、平均獲卵數及可移植周期率均無顯著差異(P>0.05);R-ICSI組和ICSI組患者原發不孕比例顯著高于IVF組(P<0.05),繼發不孕比例顯著低于IVF組(P<0.05),但R-ICSI組和ICSI組之間無顯著差異(P>0.05);R-ICSI組無患者使用卵泡期長方案,IVF組和ICSI組使用卵泡期長方案促排卵的周期比例無顯著差異(P>0.05);R-ICSI組使用黃體期長方案促排卵的周期數比例顯著高于IVF組(P<0.05),但與ICSI組無顯著差異(P>0.05);3組使用超長方案和拮抗劑方案促排卵的周期數比例均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者的基本資料[(-±s),n(%)]

二、3組患者的受精情況比較

R-ICSI組和ICSI組患者的總受精率和正常受精率均高于IVF組(P<0.05),但MⅡ率、多精受精率、優胚率、囊胚形成率和可用囊胚率均顯著低于IVF組(P<0.05);R-ICSI組的總受精率和多精受精率顯著高于ICSI組(P<0.05),而囊胚形成率顯著低于ICSI組(P<0.05)(表2)。

表2 三組患者實驗室指標的比較(%)

三、3組患者新鮮胚胎移植情況及妊娠結局比較

R-ICSI組新鮮移植56個周期,IVF組新鮮移植1 059個周期,ICSI組新鮮移植259個周期。ICSI組移植D3胚胎周期比例顯著高于IVF組(P<0.05),但與R-ICSI組無顯著差異(P>0.05);3組患者在平均移植胚胎數、移植D5胚胎周期比例、臨床妊娠率、種植率、流產率、分娩率、多胎妊娠率、異位妊娠率、活產率、出生性別比、出生體重等方面均無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 三組患者新鮮胚胎移植情況及妊娠結局比較[(-±s),%]

討 論

哺乳動物的自然受精過程,包括精子與卵母細胞卵丘復合物之間的相互作用、頂體反應、精子與卵母細胞的結合和穿入、皮層反應、原核形成等關鍵節點。在整個過程中,任何一個環節出現問題,都有可能導致受精失敗。常規IVF的18 h配子共孵育最初就是根據這一受精過程來制定的。隨著ART發展的越來越成熟,臨床促排卵方案和胚胎實驗室質控也在不斷完善,但是常規IVF-ET周期仍有10%～15%的受精失敗無法避免。ICSI可以避免自然受精過程出現的失敗因素,但由于ICSI對卵母細胞的損傷和避開對精子自然篩選的過程,有可能將遺傳缺陷傳遞給下一代[9]。雖然短時受精后去除顆粒細胞結合R-ICSI可以避免完全受精失敗和過度ICSI治療,但對于所有的IVF周期實施短時受精工作量太大。既往研究表明,短時受精結合早期R-ICSI適用于夫妻雙方原發不孕、不明原因、不孕年限長的患者,可有效避免完全受精失敗或受精低下[10]。本研究中患者的一般情況分析結果顯示,短時受精結合早期R-ICSI患者原發不孕患者比率顯著高于常規IVF,這與既往研究一致,說明原發不孕是受精失敗的高危因素。在臨床中可以選取符合適應證的人群進行早受精觀察,既能對可能受精失敗的卵母細胞進行早期干預,又能提高工作效率。

個體化促排卵方案是輔助生殖助孕的關鍵環節,利用藥物誘發多個卵泡同時發育和成熟,提高獲卵率,是后續挑選可移植優質胚胎的重要保障。目前最常用的促排卵方案是使用促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑促排卵的卵泡期長方案、黃體期長方案、超長方案或GnRH拮抗劑方案。與GnRH激動劑方案相比,GnRH拮抗劑的優勢在于可以立即和直接阻斷GnRH受體,抑制促性腺激素分泌,不存在誘發睪酮激增的風險。多中心的前瞻性研究表明,GnRH拮抗劑的治療時間更短,所需的外源性促性腺激素的用量以及卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的發生率也有所降低。雖然使用拮抗劑方案的患者獲得卵母細胞和胚胎數量較少,但其與激動劑方案的成熟卵母細胞率、受精率及妊娠率是相似的[11-12]。然而,也有薈萃分析證明,拮抗劑方案的植入率和妊娠率較低[13]。一項前瞻性研究比較了ICSI周期中分別使用GnRH激動劑和拮抗劑的卵巢刺激方案對卵巢反應、優質胚胎和臨床妊娠的獨立預測因子的影響,通過多變量分析顯示,GnRH拮抗劑方案與較低水平的GnRH、較低水平的rFSH、較高獲卵數和優質胚胎率顯著相關,而GnRH激動劑方案與較高的受精率和較高的妊娠率相關[14]。本研究結果顯示,短時受精結合早期R-ICSI組和常規ICSI組中使用黃體期長方案促排卵的周期比例均高于常規IVF組,短時受精結合早期R-ICSI組和常規ICSI組的總受精率和正常受精率也顯著高于常規IVF組(P<0.05)。3組使用拮抗劑方案的周期比例雖無統計學差異,但與常規IVF組患者相比,短時受精結合早期R-ICSI組和常規ICSI組使用拮抗劑方案促排卵周期比例均下降,且優質胚胎率顯著下降(P<0.05),與上述研究結果一致。然而,3組之間的臨床妊娠率并無顯著差異(P>0.05),表明促排卵方案的差異可能是影響本研究實驗室結局的因素之一。

在短時受精結合早期R-ICSI組中,顆粒細胞在授精后4～6 h被剝除,觀察是否有第二極體排出。在這個精卵結合的關鍵節點,卵丘細胞仍緊密包裹卵細胞或受精卵,剝除卵丘細胞的反復機械抽吸行為可能會對紡錘絲造成損害,影響胚胎發育潛能。因此,顆粒細胞的去除時機尤為重要。研究證實,在授精后4 h內去除顆粒細胞多精受精率和第3天優胚率最高,5.5 h至6 h去除顆粒細胞原核形成失敗率最高[15]。本研究中,雖然短時受精結合早期R-ICSI組的卵母細胞成熟率顯著低于常規IVF組,但總受精率和正常受精率均顯著高于常規IVF組,表明短時受精結合早期R-ICSI挽救了大部分受精失敗的MⅡ卵母細胞。短時受精結合早期R-ICSI多精受精率為6.72%,顯著低于常規IVF組但高于常規ICSI組,可能是由于在精卵結合的早期對卵母細胞重復的機械抽吸也會對透明帶的完整性產生不利影響,降低透明帶阻止多精受精的保護機制。研究報道,約90%的卵母細胞在授精后6 h內釋放出第二極體,而少部分受精卵超過6 h才排出第二極體[16]。故本研究中有少部分卵母細胞也可能是碎裂極體誤判為第一極體而行R-ICSI導致的多精受精。從胚胎發育的結局看,短時受精結合早期R-ICSI組的優胚率、囊胚形成率和可用囊胚率均顯著低于常規IVF組(P<0.05),雖然R-ICSI的胚胎發育結局不如常規IVF,但兩組患者的可移植周期率和臨床妊娠結局并無顯著差異(P>0.05)。從技術的有效性看,提示短時受精結合早期R-ICSI是挽救IVF受精失敗和受精低下周期的有效措施。

在常規IVF中,配子孵育18～20 h后去除卵丘細胞以觀察受精狀態。卵丘細胞是卵母細胞的支持細胞,保護卵母細胞免受微環境的影響。卵母細胞和卵丘細胞之間的雙向通信在卵母細胞的細胞核和細胞質成熟、受精和早期胚胎發育中發揮著重要作用[17]。關于早期去除卵丘細胞的安全性一直存在爭議。最近一項研究報道了關于早期去除顆粒細胞聯合R-ICSI預防受精失敗的安全性,結果顯示,常規ICSI組與早期R-ICSI組的受精、臨床妊娠、流產、異位妊娠、活產、性別、平均胎齡、極低出生體重、巨大兒和出生缺陷等指標均無顯著差異(P>0.05),但R-ICSI組優質胚胎率較低(P<0.01),說明了早期去除顆粒細胞聯合R-ICSI可獲得良好妊娠結局,且未增加出生缺陷[18]。另一項研究比較不同時間去除卵丘細胞對胚胎發育潛力和IVF結局的影響,結果顯示,在授精后4 h去除卵丘細胞可利用胚胎率顯著降低(P=0.002),提示在早期去除卵丘細胞觀察第二極體,有可能會影響胚胎發育潛能[19]。也有研究報道,R-ICSI組優質胚胎率顯著高于ICSI組,猜測可能是由于R-ICSI時間較常規ICSI延遲幾個小時,成熟的卵母細胞更多,卵母細胞核質成熟更同步,且尚未老化,故胚胎發育潛能更好[7]。在本研究中,短時受精結合早期R-ICSI組與常規ICSI組的正常受精率、正常卵裂率、優胚率、可用囊胚率、胚胎著床率、臨床妊娠率、流產率、異位妊娠率、多胎率、活產率、出生性別比、出生體重等方面均無顯著差異(P>0.05),與大多數研究結果相似[20]。一項研究比較不同時期去除早期卵丘細胞對妊娠和新生兒結局的影響,結果表明,早期去除卵丘細胞與不良妊娠和新生兒結局無關[21]。也有研究報道,在接受早期R-ICSI的患者中,早產、雙胞胎和低出生體重新生兒的發生率更高[22]。他們猜測可能是由于早期去除卵丘細胞的過程中損害了紡錘體的完整性,從而導致雙胞胎或胎兒生長不良。此外,卵丘細胞去除過程中不適當的機械力會導致與低出生體重相關的表觀遺傳學變化[23-24]。目前,關于早期去除顆粒細胞行R-ICSI對子代安全性影響的數據不多,未來仍需要更多隨機對照試驗和大規模研究進行反復驗證,以評估其長期效果和安全性。

綜上所述,短時受精結合早期R-ICSI獲得良好的實驗室和臨床結局,有效避免患者無胚胎移植,為不孕不育患者帶來新的希望。因此,建議在患者從充分知情技術風險和局限性的前提下,對可能受精失敗或受精低下的患者實施短時受精結合早期R-ICSI進行挽救。