血清及精漿中乙型肝炎病毒的存在情況對精子質量的影響

周海速，王佩玉，余蓉，黃學鋒，費前進，鄭九嘉*

(溫州醫科大學附屬第一醫院1.生殖醫學中心;2.護理部,溫州 325000)

乙型肝炎病毒(HBV)的感染呈全球性分布,我國的感染基數非常龐大,而其中很大一部分感染者表現為隱匿性感染[1]。HBV主要通過血液和體液途徑傳播,人體感染HBV后除肝臟外,在唾液、陰道分泌物、精液等體液中都可發現病毒顆粒[2-3],同時它還可以通過血睪屏障進入睪丸組織和精液中,可能造成對精子質量的影響,降低男性生育能力[4-5]。以往的研究發現,HBV的感染對精子的參數指標和精子功能都具有一定影響[6-9]。本研究通過檢測生殖中心就診的男性血清HBV-DNA、HBeAg及HBsAg水平和精漿中HBV-DNA拷貝數及精子質量各項指標,探討血清或精漿中HBV不同的存在方式對男性精子質量及生育力的影響,以期為男性不育并HBV感染的臨床診治及乙肝的抗病毒治療提供一定的理論基礎和依據。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年1月至2021年12月于溫州醫科大學附屬第一醫院生殖醫學中心就診的男性患者臨床資料。

納入標準:(1)年齡25～45周歲;(2)血清學標志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb和血清HBV-DNA檢查結果齊全;(3)女性配偶血清HBV標志物陰性。

排除標準:(1)有睪丸、染色體、激素水平異常者;(2)合并細菌、支原體、衣原體感染等;(3)器質性及功能性不育患者(如睪丸腫瘤,重度性功能障礙等器質性疾病)。

本研究已通過本院倫理委員會批準同意(倫理審批號:臨床研究倫理Issuing Number(2023)第(092)號),所有研究對象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.分組:根據納排標準共納入2 063例患者,首先按血清HBsAg是否陽性分為兩大類:HBsAg陰性者和HBsAg陽性者;HBsAg陽性者再按血清HBsAg/HBeAg、HBV-DNA拷貝數和精漿HBV-DNA拷貝數等感染方式分組。A組:HBV未感染男性(HBsAg陰性),共1 122例;B組:僅為血清HBsAg陽性(血清HBeAg、HBV-DNA和精漿HBV-DNA拷貝數均陰性)感染者,共460例;C組:血清HBsAg、HBeAg和血清HBV-DNA拷貝均陽性,而精漿HBV-DNA拷貝陰性,共81例;D組:血清HBsAg、HBeAg和血清、精漿的HBV-DNA拷貝均陽性,共112例。血清HBsAg、HBeAg陽性而血清、精漿HBV-DNA拷貝均陰性的患者未統計在內。最終納入1 775例患者進行分析。

2.精液采集及常規檢測:受試者禁欲3～7 d,手淫法收集精液標本。收集到的所有標本在37℃水浴待完全液化后按《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊(第5版)》行精液常規檢查,采用計算機輔助精子自動分析系統(SCA2002型,MLCRORTICS.L公司,西班牙)檢測精子活動力和運動軌跡。

3.血清學檢測:采用微粒子酶免疫分析法(MEIA)檢測血清乙型肝炎標志物,包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb,試劑盒、質控品和定標液均購自美國雅培公司,按說明書要求進行檢測。

4.血清和精漿病毒DNA拷貝水平檢測:完全液化后的精液標本于3 000g離心15 min留取上清于-80℃冰箱保存,采用熒光定量聚合酶聯反應(FQ-PCR)檢測血清和精漿病毒DNA拷貝水平,檢測試劑購自深圳市匹基生物工程有限公司,操作按試劑盒說明書要求進行,精漿HBV-DNA水平>5.0×102U/ml為陽性。

5.精子形態學分析:精子形態學分析根據WHO推薦的標準改良巴氏染色法進行。

6.精子染色質擴散(SCD)檢測精子DNA完整性:采用精子Halosperm試劑盒(安徽安科生物工程)說明書介紹的方法行SCD檢測,并計算精子DNA碎片指數(DFI),DFI=(小暈輪精子+無暈輪精子)/計數精子總數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、患者的基本情況

本研究共納入2 063例患者,其中HBsAg陰性者1 122例,HBsAg陽性者941例,符合本研究排要求的所有研究對象中HBsAg陽性比例達45.6%。通過FQ-PCR檢測血清HBeAg和HBV-DNA拷貝均陽性的193例感染者后發現精漿HBV-DNA拷貝數陽性者112例,占HBV感染者的11.9%(112/941)。與未感染者(A組)相比,HBV感染者(B、C、D組)的谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)水平均顯著升高(P<0.05),且B、C、D組間的ALT和AST水平也有顯著差異(P<0.05);精漿HBV-DNA拷貝陽性感染者(D組)的不育年限顯著高于未感染者(P<0.05)(表1)。

表1 各組患者的基本情況比較(-±s)

二、血清和精漿中HBV的存在情況對精液常規參數的影響

分析各組間的精液參數指標發現,與未感染者(A組)相比,B、C、D組患者的精子濃度、前向運動精子比例均顯著下降(P<0.05),不活動精子比例顯著增加(P<0.05);進一步的組間分析顯示,D組的精子濃度、PR均顯著低于B組和C組(P<0.05),IM則顯著高于B組和C組(P<0.05);A組的精子濃度和PR為4組中最高(P<0.05),D組患者的精液液化時間最長,顯著高于其余3組(P<0.05)(表2)。

表2 各組患者精液常規參數比較(-±s)

三、血清和精漿中HBV的存在情況對精子形態及DNA損傷的影響

統計分析各組間的精子形態學差異,結果顯示,B、C、D組的正常精子形態比例均顯著低于A組(P<0.05),但B、C、D三組間無顯著性差異(P>0.05)。進一步比較各組精子的頭部、頸部、尾部缺陷率等指標,HBV感染者中B和C組的頭部缺陷精子、B組的頸中段和尾部缺陷的精子占比均顯著高于未感染者(A組)(P<0.05);D組感染者的頸中段缺陷精子占比顯著高于B組和C組,D組感染者的尾部缺陷精子占比顯著高于C組。各組間的精子畸形指數和異常指數均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 各組患者的精子形態學參數比較(-±s)

我們日常臨床上經驗認為精子DNA碎片指數(DFI)25.0%是精子DNA損傷的臨界值,分析各組間的DFI結果顯示:與A組相比,B、C、D組的精子DFI顯著增加(P<0.05),尤其是D組的DFI最高,亦顯著高于B、C兩組(P<0.05),且數值上超過了臨界值(表3)。

討 論

影響男性生育力的眾多因素中微生物感染是重要原因之一,而HBV感染已被發現與男性精子質量之間有著密切的相關性,因為在感染HBV后,感染者的陰道分泌物、精液等較多的肝外組織或細胞中都可發現病毒的存在[10-13];同時也發現,部分HBV感染后病毒DNA可整合到男性生殖細胞的染色體上并垂直傳給后代,影響男性生育力[14]。已有學者報道,HBV感染的男性有多項精液參數指標均比未感染者顯著性降低。我們前期的研究[6-8]也已發現,血清HBsAg及HBV-DNA呈陽性的男性,其精子濃度、精子活力、形態學指標和精子DFI及頂體酶活性等均顯著低于未感染者。但是,目前關于HBV感染對男性生育力的影響研究,都僅僅停留在比較簡單的統計分析,比如僅對血清HBsAg陽性或陰性分組,或比較簡單的按“大三陽”“小三陽”等感染模式分組,很少有進一步細化并探究病毒在男性不同體液(血液及精液)中的存在對男性精子質量造成的影響,也缺乏對血清和精漿HBV-DNA拷貝數結果進行系統的分組研究。本研究是在前期研究的基礎上通過HBV不同的感染模式進一步按血清HBsAg/HBeAg、HBV-DNA是否陽性分組,同時檢測病毒處于活躍復制期感染者的精漿中HBV-DNA拷貝水平,深入探討血清或精漿中HBV的存在情況及對男性精子質量的影響。

本研究從2016年1月至2021年12月,歷經6年時間共收集在本中心就診的2 063例男性精液標本,其中HBV感染者941例;再根據其血清乙肝標志物和HBV-DNA拷貝數進行分組,其中460例HBV感染者僅表現為單純血清HBsAg陽性(B組),另有193例為血清HBsAg、HBeAg和血清HBV-DNA拷貝同時陽性(C組)、病毒處于復制期的患者,對其精漿病毒DNA檢測發現,112例患者精漿HBV-DNA水平>5.0×102U/ml,表現為血清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA拷貝均陽性且精漿HBV-DNA拷貝也為陽性(D組)。組間分析顯示,HBV感染者的精子濃度、PR及正常形態精子百分數均顯著低于未感染者,IM和精子DFI均顯著高于未感染者。進一步分析發現,在HBV感染者的精漿中檢測出病毒DNA拷貝呈陽性時,即血清和精漿同時存在病毒復制的HBV感染者,其精子各參數指標受到的負面影響最明顯,表現為精子濃度、PR均顯著低于精漿HBV-DNA拷貝陰性的感染者。男性精子濃度、活動力和形態受到很多因素的影響,如局部環境的溫度、某些藥物、精子的核基因或線粒體基因異常、染色體蛋白組型異常等[15-18];此外,男性長期慢性HBV感染也是造成精子濃度和活力降低的因素之一[4,6,9]。雖然,目前的研究表明HBV慢性感染的男性精子質量低于未感染者,但病毒感染后是通過何種途徑或機制影響精子濃度和活力尚未完全闡明,部分學者的觀點是病毒在體液(包括血液和精液)中復制時病毒顆粒吸附在精子表面,從而影響其運動。Zhou等[19]研究發現,HBV表面S蛋白可定向作用于精子頭部唾液酸糖蛋白受體,調動局部的免疫反應或造成局部環境的炎性反應,產生過量的活性氧類物質,損傷精子線粒體膜電位,進而影響到氧化磷酸化能量的供應,使精子能量不足,從而降低了精子的活力,最終影響到精子獲能和受精等能力。

HBV是一種逆轉錄病毒,此類病毒在自我復制時很容易整合到宿主的染色體中。已有研究證實[20],能夠穿過血睪屏障進入睪丸的HBV-DNA在睪丸組織中復制時,病毒的DNA有很高的風險會整合到精子的染色體中,這種整合一旦發生就會誘導精子的染色體發生變異,導致精子遺傳物質出現異常,所以HBV感染者尤其是精漿中HBV-DNA高拷貝的感染者其精子染色體畸變率要顯著高于未感染者。以往研究發現,HBV感染男性的精子DFI顯著升高,甚至其DFI水平可達到正常男性2倍或以上[9,21]。本文研究結果顯示,HBV感染者的DFI顯著高于未感染者,與以往研究結果一致。同時我們進一步的研究分析發現,血清或精漿中病毒DNA的存在對精子DNA完整性有不同的影響,在HBV感染者中,當精漿HBV-DNA陽性時其DFI高達(26.2±15.7)%,顯著高于精漿HBV-DNA陰性的HBV感染者[(17.8±10.8)%、(16.2±7.6)%],且超過了臨床上都普遍認為的25.0%的臨界值。通過本研究并結合其他學者的結論,我們推測:HBV感染后尤其當病毒進入到睪丸組織在精液中復制時,可能會增加精子染色體的畸變頻率,進而影響精子遺傳物質的穩定性,如造成精子DNA損傷加劇;其次,當病毒進入睪丸存在于精漿中時,更容易誘發一些免疫應答或炎性反應,引起睪丸局部微環境的改變并產生大量的有害物質,如活性氧等。這些病毒感染所帶來的微環境的變化可能會對精子的形成或成熟造成一定程度的影響,當這些負面影響達到或超過一定的閾值時,最終影響精子的質量和功能[22]。

我國是“乙肝”大國,HBV感染基數龐大,且有眾多的感染者正處于婚育年齡,而關于HBV感染與男性精子質量的研究相對較少,因HBV感染影響精子遺傳物質(如精子DNA損傷等)的穩定性從而導致男性不育研究在國內外更鮮有報道。本研究發現,男性感染HBV后精子的各參數指標變化顯著,尤其當精漿中存在病毒DNA復制時精子各指標均顯著低于精漿病毒DNA陰性的HBV感染者和未感染者,提示當男性血清或精漿中的乙肝病毒呈陽性狀態時對男性精子質量會造成一定的影響,尤其當HBV感染男性血清和精漿中HBV-DNA拷貝同時陽性狀態時可能會對精子各參數指標造成進一步的負面影響。而HBV感染對精子的這些負面影響是如何造成的,其影響機理是否與氧自由基、活性氧類物質有關,我們將在現有研究的基礎上,后續通過體外試驗作進一步的研究,以便揭示HBV感染引起男性生育力下降的相關機制,為HBV感染的男性不育的診治提供臨床基礎。