燈盞花倍性的流式細胞術檢測優化

王夢欽，董云龍，徐 達，陳曉波，張云峰，2

（1.云南師范大學生命科學學院，昆明 650500；2.生物能源持續開發利用教育部工程中心，昆明 650500）

多倍化是植物新物種形成的重要方式，在自然界中廣泛發生，可以幫助物種具備更廣泛的環境適應能力，在高等植物進化中占有重要地位［1］。植物多倍化后形成更大的營養儲存器官［2］，產生更快、更為豐富的次生代謝產物［3］，具有更強的抗病性和更好的環境適應性［4］。諸如異源多倍體化的燕麥（Avena sativa）、小麥（Triticum aestivum）、甘蔗（Saccharum officinarum）以及同源多倍體化的馬鈴薯（Solanum tuberosum）、草莓（Fragaria ananassa）、咖啡（Coffea arabicaL.）、煙草（Nicotiana tabacumL.）等為人類生產所利用［5］。燈盞花（Erigeron breviscapusHand.）又名短葶飛蓬、燈盞細辛，為菊科（Compositae）飛蓬屬植物，主要分布于中國云南?。ㄕ既珖?5%以上），少數分布于四川、貴州和西藏等地［6］，可用于治療高血壓、心腦血管病等多種疾?。?］。燈盞花人工大田栽培病蟲害嚴重，連作障礙明顯，嚴重制約了燈盞花產業的可持續發展［8］。燈盞花多倍體具有株型大、有效成分較高、抗性強等特性，進行燈盞花的多倍體品種選育是燈盞花育種的一種有效嘗試［9］。

傳統的植物倍性鑒定主要通過器官形態差異觀察、生理生化指標測定、氣孔大小檢測等方法進行推測，準確度不高。采用染色體計數法雖然直觀、準確，但對于染色體數目多、染色體小的植物而言，其技術要求相對較高［10］。流式細胞技術可針對細胞核中的DNA 進行熒光標記，快速準確地測定其DNA 含量和倍性水平［11］，已廣泛用于蘋果（Malus pumilaMill.）、梨（Pyrus communis）、桑樹（Morus albaLinn.）、菘藍（Isatis indigoticaFortune）、草莓、水稻（Oryza sativaL.）、櫻桃（Cerasus pseudocerasus G.Don）、馬鈴薯等的鑒別［12］。

菊科植物由于酚類、糖類物質含量較高，進行細胞裂解時易發生氧化反應造成細胞核沉積、黏連，影響了流式細胞儀的檢測效果，尤其是多倍體的檢測效果不佳。本研究通過對制樣方式、細胞核懸液及熒光染料染色劑等工藝進行優化，建立燈盞花倍性鑒定的方法，旨在為燈盞花大規模的倍性鑒定奠定基礎，推動燈盞花的育種工作。

1 材料與方法

1.1 材料

以云南師范大學生物工程中心遺傳實驗室培養的二倍體和四倍體燈盞花為材料來源，選取在MS 培養基中正常生長3 周左右的幼嫩葉片為供試材料。

1.2 解離液及染色液的配制

共設計3 種細胞解離液和2 種PI 染色液，其配方成分詳見表1。

表1 解離液和染色液成分

1.3 制樣方法

1.3.1 機器研磨法 將葉片用滅菌dd H2O2沖洗干凈，擦干，放入離心管中加入鋼珠，同時加入2 mL 解離液，放入研磨機中，溫度設置為4 ℃，研磨1 min。

1.3.2 液氮研磨法 將葉片用滅菌dd H2O 沖洗干凈，擦干，放入研缽中，加入5～10 mL 液氮迅速研磨成粉末，然后加入2 mL 預冷的解離液，再將其轉入1.5 mL 離心管中插入冰上裂解30 min。

1.3.3 刀片切碎法 將葉片用滅菌dd H2O 沖洗干凈，擦干，放入培養皿中同時加入2 mL 解離液，用吉利刀片迅速切2 min。

1.4 植物組織單細胞制備方法

選取培養瓶中生長狀況好的幼嫩葉片，用滅菌dd H2O 沖洗干凈、擦干后，按照“1.3”方法進行樣品制備；隨后用400 目的濾膜過濾至1.5 mL 離心管中，于4 ℃下靜置10 min 后離心，轉速1 000～2 000 r/min離心5 min，棄上清液，取沉淀物。在試管中加入預冷的按照“1.2”方法制備的解離液1 mL，加20 μL 1 mg/mL 預冷的染料，使其懸浮液與染料結合，4 ℃避光保存15～20 min，用400 目的濾膜過濾至上機管中待測。

1.5 流式細胞術測定與數據分析

使用艾森生物ACEA NovoCyte 型流式細胞儀，按照儀器操作說明進行測定，采用NovoExpress 1.3.0軟件處理數據。以細胞核DNA 相對含量的總熒光強度為橫坐標，細胞核數量為縱坐標，繪制流式峰值圖；以細胞的總熒光強度為橫坐標，細胞核顆粒度為縱坐標，繪制流式散點圖。

2 結果與分析

2.1 不同方法制備的細胞核懸液效果比較

分別采用液氮研磨法、刀片切碎法和機器研磨法3 種方法制備燈盞花葉片樣品，使用流式細胞儀進行細胞核懸液效果檢測（圖1）。由圖1 可知，液氮研磨法和機器研磨法中細胞核沒有顯著聚集在一起，而刀片切碎法在總熒光強度106和106.2處分別呈現出細胞核的顯著聚集，且不同熒光強度的2 個細胞核群可以完全地分開，表明刀片切碎法收集到了完整的細胞核。此外，圖1c 中的細胞核聚集較為緊密，細胞核占比為67.77%。結果表明，刀片切碎法制備的燈盞花流式細胞樣品效果較好。

圖1 不同方法制備的細胞核懸液效果比較

2.2 不同細胞解離液解離的效果比較

采用3種細胞解離液分別對二倍體燈盞花（圖2）和四倍體燈盞花細胞（圖3）進行植物組織單細胞裂解。由圖2 可知，采用解離液Ⅰ處理燈盞花二倍體葉片細胞，燈盞花葉片的流式細胞檢驗圖峰型清晰且集中，在總熒光強度1.2 處出現峰值；解離液Ⅱ處理的樣品，檢驗圖出現了明顯的雜亂峰；解離液Ⅲ處理的樣品，峰型集中但不夠清晰，總熒光強度1.2 后有雜亂峰。由圖3 可知，解離Ⅰ處理的燈盞花四倍體葉片細胞出現了集中且清晰的2 個峰型，比二倍體更明顯；解離液Ⅱ和解離液Ⅲ處理的樣品，雖測出1 個峰，但峰型表現雜亂。結果表明，采用細胞解離液Ⅰ對燈盞花細胞進行裂解，不僅出峰清晰，且能較好地呈現出二倍體和四倍體細胞核DNA 峰型。因此，本研究選擇解離液Ⅰ。

圖2 不同解離液處理二倍體燈盞花葉片的流式細胞檢驗

圖3 不同解離液處理四倍體燈盞花葉片的流式細胞檢驗

2.3 不同染色液的效果比較

采用刀片切碎法制備樣品，經解離液Ⅰ裂解后的細胞懸液分別用不同公司的PI 染色液進行染色，結果（圖4）表明，使用BioFroxx 公司的粉末自配染色液可以明顯減少細胞碎片造成的背景干擾，染色效果明顯。因此，本研究選擇BioFroxx公司的PI 染色液。

2.4 對繼代苗體細胞變異的檢驗

在植物組織培養過程中，體細胞變異（Somaclonal variation）是時常發生的事件［13］，尤其是繼代數超過12 次以后。在燈盞花的組織培養過程中，發現再生植株呈現出不同的表型，對其葉片進行流式細胞測定，發現不同表型呈現出不同的峰型（圖5）。圖5a 燈盞花植株的流式細胞檢驗為二倍體，圖5b 為單倍體，圖5c 為四倍體，圖5d 為混倍體，并進行了驗證試驗。組織培養過程中最常見的遺傳不穩定性是倍性變化［14］，體細胞無性系核型的改變包括染色體重排、非整倍體和整倍體。非整倍體可能是由染色體不分離、異常紡錘體、滯后染色體和/或染色體斷裂引起的［15］。其中，多倍體化是染色體數量上最常見的變化，通常由內多倍體化（核內重復或有絲分裂）或核聚變引起［16］。許多研究表明，基因型［15］、繼代培養次數、培養基類型、外植體狀況都會導致體細胞無性系變異［17］，尤其是培養基中2，4-d 的運用［18］。盡管如此，鮮見燈盞花組培中體細胞變異的相關報道。本研究表明，在燈盞花的組培快繁中的確存在體細胞變異。下一步可以利用組培過程中的變異體細胞篩選有用的變異株。

圖5 流式細胞檢驗優化流程對燈盞花繼代再生苗的檢驗

3 小結

利用染色體計數方法鑒定植株倍性，雖準確率高但操作繁鎖，且技術要求高，所需材料為根尖，而取根通常會影響植物的正常生長，且不易鑒定出混倍體［10］。流式細胞檢測不僅操作簡單，取材多元化，且能測定基因組大小及鑒定混倍體。有許多因素會影響到流式細胞的檢驗結果，如材料來源［19］、細胞核解離液類型［20］、膜過濾次數［21］、DNA 熒光染料類型［22］等，尤其是材料選取不當，酚類、多糖、單寧等雜質的干擾會導致解離出來的單細胞核顆粒少，甚至形成較大的染色體峰。但是，采用適宜的解離液和解離方法可以消除此類干擾［23］。燈盞花多糖、酚類物質含量較高，本研究采用刀片研磨法制備樣品，選擇解離液I 進行植物組織裂解，使用Bio-Froxx 公司染料進行染色。優化后的工藝不僅能較好地檢驗燈盞花的倍性，同時也能檢驗出再生植株中的混倍體和單倍體。建立的流式細胞術測定燈盞花倍性檢驗體系，可為燈盞花多倍體育種提供參考。