高效液相色譜-串聯質譜法測定金銀花中植物生長調節劑的殘留量

林俊燕，馬恩耀，2，周勁松，2，孫心恒，羅麗娟，盧敏茹

（1.廣東漢潮中藥科技有限公司/廣東省傳統中藥創新中心，廣州 510000；2.廣州采芝林藥業有限公司，廣州 510360）

由于毒副作用小，符合回歸自然的發展理念，中藥材越來越受到人們的歡迎，使得中藥材的生產量和消費量不斷增加。中醫藥事業在中國發展迅速，已經形成了基于《中華人民共和國藥典》藥品標準體系。常用中藥材大部分都是通過種植獲得。

植物生長調節劑（Plant growth regulator，PGR）是可以顯著改變植物生長發育的化學物質［1］，根據不同功效可分為三大類：植物生長抑制劑、植物生長促進劑和植物生長延緩劑。與傳統農業技術相比，植物生長調節劑具有高效、低毒的特性，在促產增量、改質抗逆等方面發揮了重要作用［2］。植物生長調節劑已廣泛應用于中藥材的種植栽培，有研究發現，植物生長調節劑已經在幾種根及根莖類藥材種植過程中大量使用［3］。植物生長調節劑使用不合理會導致其在中藥材中的殘留，存在降低中藥材活性成分含量和危害食用者健康的風險［4-6］。中國現已制定食品類產品中部分植物生長調節劑的最大殘留限量標準（GB 2763—2021）［7］，而中藥材中植物生長調節劑的殘留限量與檢測標準尚不明確，導致中藥材種植中植物生長調節劑的使用日漸增多，嚴重影響了中藥材的質量和安全，造成較大隱患。因此，建立相應的檢測方法是十分必要的。

植物生長調節劑殘留量的檢測方法包括傳統分析方法（化學法、電位滴定法）和色譜法（氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等），其中LCMS/MS 以其可檢測成分微量、準確的特點，已成為檢測農藥殘留的主要方法［8］。本研究針對實際生產過程中，金銀花可能使用過植物生長調節劑進行栽培，產品存在植物生長調節劑殘留將影響產品的質量安全，結合實際工作，建立一種快速、簡單的LC-MS/MS 方法，用于金銀花藥材中8 種植物生長調節劑農藥的殘留量測定，以滿足日常檢驗工作。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

金銀花藥材購自藥材市場。

Agilent 1290-6470 型液相色譜質譜聯用儀；TDL-400R 型離心機；ML203T 型天平；EOAA-VM-B型渦旋儀；數控超聲波清洗器。

苯醚甲環唑、多效唑、烯效唑、矮壯素、氯化膽堿、蕓苔素內酯、對硝基苯酚鈉、脫落酸（純度大于99.0%），上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈（色譜純），上海星可高純溶劑有限公司；甲酸（色譜純），阿拉丁；甲酸銨（色譜純），天津市科密歐化學試劑有限公司；超純水。

1.2 供試品溶液制備方法

取樣品粉末（過三號篩）1.0 g，精密稱定，置于50 mL 離心管中，加入含1%甲酸的乙腈10 mL，渦旋1 min后，超聲提取10 min，10 000 r/min下離心5 min，取1 mL 上清液，加水1 mL，混合液經渦旋1 min 后過0.22 μm 微孔濾膜，按儀器工作條件進行測定。

1.3 對照品溶液的配制

1.3.1 對照品儲備溶液的制備 分別精密稱取8 種植物生長調節劑標準品，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/mL 的對照品儲備溶液，密封儲存于-20 ℃冰箱。

1.3.2 混合對照品工作溶液的制備 精密量取苯醚甲環唑、多效唑、烯效唑、矮壯素、氯化膽堿、對硝基苯酚鈉對照品儲備溶液0.1 mL，蕓苔素內酯、脫落酸對照品溶液0.5 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成苯醚甲環唑、多效唑、烯效唑、矮壯素、氯化膽堿、對硝基苯酚鈉濃度為10 μg/mL，蕓苔素內酯、脫落酸濃度為50 μg/mL 的混合對照品工作溶液，密封儲存于-20 ℃冰箱。

1.3.3 標準工作液的制備 取金銀花空白基質藥材，按照“1.2”的制備方法處理制成空白基質溶液，使用時用空白基質提取溶液稀釋混合對照品溶液配成苯醚甲環唑、多效唑、烯效唑、矮壯素、氯化膽堿、對硝基苯酚鈉濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L，蕓苔素內酯、脫落酸濃度為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L 的標準工作液。

1.4 色譜與質譜條件

1.4.1 液相色譜測定條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相：A 為乙腈；B 為5 mmol/L 甲酸銨含0.1%甲酸水；0～2.5 min，5%A→15%A；2.5～5.0 min，15%A→70%A；5.0～7.0 min，70%A→80%A；7.0～11.0 min，80%A→95%A；11.0～11.5 min，A 為95%；流速為0.30 mL/min；進樣量為5.00 μL；柱溫為40 ℃。

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），正、負離子檢測模式下，使用多反應監測（MRM）模式進行測定。離子源溫度為250 ℃；鞘氣溫度為350 ℃；干燥溫度為350 ℃；霧化器壓力為60 psi；正離子模式毛細管電壓為4 000 V；負離子毛細管電壓為3 500 V。

1.5 方法學驗證

1.5.1 線性和范圍 為減少基質對測定結果的影響，采用金銀花空白基質提取液加標的方式制備系列濃度的混合對照品溶液，使標準溶液系列和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品基質干擾。將不同濃度的混合對照品溶液，按照“1.4”中的分析條件進行測定，以各植物生長調節劑的濃度（X）為橫坐標，定量離子對峰面積（Y）為縱坐標繪制校準曲線。

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1.5.2 檢測限和定量限 取基質混合對照溶液，稀釋后注入儀器進行分析，以信噪比（S/N）為3 時的濃度所對應的含量為檢測限（LOD），以信噪比（S/N）為10 時的濃度所對應的含量為定量限（LOQ），確定8種植物生長調節劑的檢測限和定量限。

1.5.3 重復性 精密稱取同一批金銀花藥材粉末（過三號篩）6 份（每份1.0 g），分別添加相同濃度的混合對照品溶液，按“1.2”的方法制備后按“1.4”的條件分析，計算6 次結果的RSD。

1.5.4 加樣回收率 精密稱取金銀花空白樣品9 份（每份1.0 g），分別添加低、中、高3 個濃度的混合對照品溶液，每種濃度各添加3 份，按“1.2”的方法制備后按“1.4”的條件分析，計算這3 組樣品的加樣回收率，分析其RSD。

1.5.5 樣品測定 利用建立的方法對25 批次金銀花藥材樣品進行檢測。

2 結果與分析

2.1 色譜條件與質譜條件的優化

2.1.1 色譜條件的優化 對8 種植物生長調節劑的色譜條件進行選擇和優化，結果表明這8 種植物生長調節劑在C18 色譜柱得到很好的保留。以甲醇作為有機相的流動相時，液相系統壓力較大，色譜峰型較寬，而采用乙腈作為有機相的流動相時，液相系統壓力合適，色譜峰尖銳對稱。以乙腈+5 mmol/L 甲酸銨含0.1%甲酸水溶液作為流動相，梯度洗脫分離，可以達到滿意的分離效果，8 種植物生長調節劑能與基質雜質實現良好的分離，如圖1 所示。

圖1 植物生長調節劑10.0 μg/L 混合對照品工作溶液MRM 色譜

2.1.2 質譜條件的優化 根據8 種植物生長調節劑的性質與分子結構，在ESI 源中將一定濃度的混合對照品溶液注入液相色譜串聯質譜儀，在得到的碎片離子中選取其中2 對離子作為監測離子對，優化多反應監測（Multiple reaction monitoring，MRM）離子對碰撞能和其他質譜參數（表1）。

表1 多反應離子監測分析參數

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性和范圍 以各植物生長調節劑的濃度（X）為橫坐標，定量離子對峰面積（Y）為縱坐標繪制校準曲線，觀察其線性回歸方程和線性相關系數，結果見表2。由表2 可以看出，各化合物在設計的范圍內線性關系良好。

表2 植物生長調節劑各化合物的線性回歸方程和范圍

2.2.2 檢測限和定量限 8 種植物生長調節劑的檢測限（LOD）為0.000 9～0.045 6 mg/kg，定量限（LOQ）為0.001 8～0.152 0 mg/kg，具體結果見表3。

表3 各植物生長調節劑的檢測限和定量限

2.2.3 重復性 經測定，結果顯示6 份同一批金銀花藥材粉末的RSD為1.08%～8.46%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 加樣回收率 結果顯示，8 種植物生長調節劑的加標回收率在71.45%～120.37%，RSD在2.33%～9.48%。結果表明，本研究建立的8 種植物生長調節劑殘留測定法的加樣回收率良好，可用于金銀花藥材中8 種植物生長調節劑的定量分析。

2.3 樣品測定

利用建立的方法對25 批次金銀花藥材樣品進行檢測，檢出情況見表4。由表4 可知，所有批次金銀花藥材未檢出氧化膽堿、蕓苔素內脂、對硝基苯酚鈉。有13 批次的樣品檢出有植物生長調節劑殘留，占總批數的52%，濃度在3.58～133.59 μg/kg，其中多效唑檢出率最高，其次為烯效唑。雖然這次考察的基數較小，但是也可以在一定程度上反映金銀花在種植中使用植物生長調節劑的情況，存在植物生長調節劑殘留，影響產品的質量安全。結果表明，有必要對已經被登記在中藥材種植使用的農藥制定相應的殘留限量，確保這些藥材的質量安全。

表4 金銀花藥材樣品植物生長調節劑的殘留量測定結果（單位：μg/kg）

3 討論

金銀花屬于藤本植物，它的孕蕾及開花均是通過生殖生長來完成的。土壤環境條件發生改變時，植物的次生代謝過程就會受到促進或抑制。作為金銀花的主要有效成分綠原酸，《中華人民共和國藥典（2020 年版）》［9］對其含量有規定，綠原酸屬于植物的次生代謝產物，其生物合成與積累是金銀花植株長期適應外界環境條件的結果。

本研究考察了25 批次的金銀花藥材樣品，有13批次的樣品檢出植物生長調節劑殘留，檢出率達52%，其中檢出頻次較高的是多效唑、烯效唑和矮壯素。

多效唑、烯效唑以及矮壯素都具有抑制植物營養生長的作用，在金銀花孕蕾期間，噴施一定濃度的多效唑、烯效唑以及矮壯素能抑制金銀花的營養生長，促進金銀花的生殖生長。徐迎春等［10］通過研究金銀花噴施不同濃度的多效唑，結果發現，多效唑可以抑制花枝的伸長生長，增加其葉面積和產量，同時可以提高金銀花中綠原酸的含量。有研究表明，矮壯素、多效唑等植物生長調節劑可以提高金銀花的單株產量，且調節劑施用的濃度與施用時間可以改善金銀花的品質［11］。

本方法樣品經1%甲酸乙腈提取后，采用高效液相色譜-串聯質譜進行分離和測定植物生長調節劑。方法學考察及樣品測定證明，該方法簡單、快速、靈敏度高，并具有良好的精密度與準確度，符合農藥殘留分析的要求，可用于金銀花藥材中植物生長調節劑殘留的定性和定量分析，為金銀花藥材中植物生長調節劑限量的設定提供技術支持。