MicRNA-126 與肝癌細胞增殖、凋亡的關系研究

李寧，崔中鋒，李琤

（河南省傳染病醫院，河南 鄭州 450000）

肝癌是世界上第五大最常見的癌癥， 也是全球第三大與癌癥相關的死亡原因[1]。 盡管近年來在肝癌診斷和治療方面取得了不錯的進展， 但肝癌患者長期預后仍然很差， 晚期肝癌患者5 年生存率低于5%[2]。 證據表明，肝內復發和轉移是影響肝癌患者預后不良的危險因素[3]。 但肝癌復發和轉移的分子機制尚未完全闡明。 肝癌發生和發展與包括microRNAs 在內的多種基因有關。 microRNA 是一類長度為21～25 個核苷酸的內源性小RNA，可在轉錄后水平或翻譯水平上負調控基因表達，從而參與調控細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等多種細胞生物學過程[4]。研究顯示，micRNA-126 在胃癌[5]、肺癌[6]、前列腺癌[7]等多種腫瘤中下調表達，可能發揮抑制腫瘤發生和發展的作用。 亦有文獻報道，micRNA-126 在肝癌組織中的表達顯著低于癌旁組織和正常組織， 且micRNA-126 低表達是影響肝癌患者預后不良的獨立因素[8]。但有關micRNA-126 影響肝癌細胞生物學功能作用的報道較少。本研究旨在分析探討micRNA-126 對肝癌細胞增殖、凋亡的影響及其相關機制，現詳細報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞株 16 只BALB/c 裸鼠（4～5 周齡）購買自上海斯萊克實驗動物有限公司，體質量16～22 g，實驗動物合格證號：SYXK（滬）2019-0008，人肝 癌 細 胞 株HepG2、MHCC97-L、PLC、Huh7 以 及人肝細胞株L02 購買自中國科學院上海細胞庫，micRNA-126 mimics 和micRNA-126 NC 均購買自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 試劑和儀器 胎牛血清、 胰蛋白酶消化液、DMEM 培養基、青霉素-鏈霉素溶液（批號或貨號分別為：SV30184.02、J160030、AB216496、SV30010。美國Hyclone 公司）；MTT、二甲基亞砜（批號或貨號分別為：303H0523、D8371。北京索萊寶科技有限公司）；轉染試劑Lipofectamine 3000（批號或貨號：L3000-015。 美國Invitrogen 公司）；蛋白酶抑制劑（批號或貨號：P7626。 美國Sigma 公司）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素 （Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（批號或貨號：A211-01。南京諾唯贊生物科技有限公司）；PrimeScriptTM RT reagent 試劑盒 （批號或貨號：RR037A。 日本Takara 公司）；LightCycler 480 SYBR Green I Master 試劑盒 （批號或貨號：4887352001。 Roche 公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒 （批號或貨號分別：R0010、PC0020。北京索萊寶科技有限公司）；ECL 化學發光試劑盒（批號或貨號：P0018M。杭州碧云天生物技術研究所）； 羊抗PIK3R2、PI3K、PDK1、AKT、p-PI3K、p-PDK1、p-AKT、GAPDH抗體 （批號或貨號分別為：PA5-101022、MA1-74183、MA5 -15797、MA5 -14916、PA5 -104853、PA5-104700、44-621G、MA5-15738-D680，Thermo Fisher 公司）； 辣根過氧化酶標記二抗 （批號或貨號：bs-40296G。 北京博奧森生物技術有限公司）；CO2 細胞培養箱（型號：HF151UV。 上海力新儀器有限公司）；紫外分光光度計（型號：Q5000。 美國Quawell 公司）；流式細胞儀（型號：FACScanto II。美國BectonDickinson 公司）； 實時熒光定量PCR儀 （型號：FTC-3000。 上海楓嶺生物技術有限公司）；蛋白印跡電泳儀（型號：Power PacTM HC。 美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 將人肝癌細胞株HepG2、MHCC97-L、PLC、Huh7 和人肝細胞株L02 置于含有10%胎牛血清的DMEM 培養基中于37 ℃、5%的CO2 細胞培養箱中進行培養，每1～2 d 傳代一次。

1.3.2 總RNA 提取、逆轉錄以及RT-PCR 檢測 收集對數生長期的人肝癌細胞株HepG2、MHCC97-L、PLC、Huh7 和人肝細胞株L02，加入1 mL Trizol 溶液，上下顛倒混勻，并以1∶1 比例加入氯仿，再加入500 μL 提前預冷異丙醇，提取總RNA。 于260 nm和280 nm 處測定吸光度， 并使用PrimeScriptTM RT reagent 試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA。 將所得cDNA 稀釋5～50 倍進行RT-PCR 反應（反應體系：上游、下游引物0.5 μL，SYBR GREEN 0.3 μL，2×Taq Master Mix 10.0 μL，cDNA 1.0 μL， 加 無RNase 水至20.0 μL。 反應程序：95 ℃、5 min，預變性；95 ℃、10 s，變性，60 ℃、20 s，復性，72 ℃、15 s，延伸，40 個循壞；72 ℃、5 min 延伸， 以U6 為內參基因，引物序列：F：5‘- CTTAGTTGCGTTACACCCTT TCTTG-3’，R：5‘-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGT TT-3’， 引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，實驗重復三次， 目的基因micRNA-126 mRNA 相對表達水平采用2-△△Ct法進行計算。

1.3.3 細胞轉染 當HepG2、MHCC97-L 細胞密度長至80%～90%時，棄液，并使用PBS 磷酸緩沖液沖洗；加入0.25%胰蛋白酶消化液進行消化，收集細胞混合液，1 000 rpm 離心5 min；棄液，加入新鮮完全培養基重懸細胞，以每孔1×105個細胞接種至6 孔細胞板中， 置于37 ℃、5%的CO2細胞培養箱中進行培養。 第二天，觀察細胞生長狀態良好，用移液槍輕輕吸走培養液， 加入不含胎牛血清的DMEM 培養基，分別轉染micRNA-126 mimics（micRNA-126 mimics 組）和micRNA-126 NC（micRNA-126 NC 組），control 組不轉染任何序列， 置于37 ℃、5%的CO2細胞培養箱中培養4 h；用移液槍輕輕吸走培養液， 并加入含有10%胎牛血清的DMEM 培養基，放回CO2細胞培養箱中繼續培養。

1.3.4 MTT 檢測肝癌細胞增殖能力 分別取5×103個HepG2、MHCC97-L 細胞接種至96 孔細胞板中，設置6 個復孔，培養至細胞貼壁開始轉染micRNA-126 mimics 和micRNA-126 NC。 同時設置空白對照組， 置于37 ℃、5%的CO2細胞培養箱中培養，于24 h、48 h、72 h 以及96 h 時進行MTT 檢測，具體操作為：分別于24 h、48 h、72 h 以及96 h時用移液槍輕輕吸走培養液， 加入100 μl 新鮮DMEM 培養基+10 μL MTT 混合液 （濃度為5 mg/mL），置于37 ℃、5%的CO2細胞培養箱中培養4 h；用移液槍輕輕吸走培養液，并加入150 μL 二甲基亞砜，避光靜置10 min，于450 nm 處測定吸光度。

1.3.5 流式細胞儀檢測肝癌細胞凋亡能力 分別取生長至80%～90%的HepG2、MHCC97-L 細胞接種至6 孔細胞板中，設置6 個復孔，當細胞生長至密度為80%～90%時進行轉染，操作同1.3.3；轉染48 h，棄液，PBS 沖洗， 加入0.25%胰蛋白酶消化液消化細胞，收集細胞混合液并離心，調整細胞密度為1×105個細胞，PBS 沖洗兩次；各組細胞分別加入500 μL Binding Buffer， 吹打混勻； 再分別加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，避光孵育15 min；取1×106個細胞，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.6 RT-PCR 檢測轉染前后micRNA-126 表達水平轉染48 h，取對數生長期細胞提取總RNA，檢測各組micRNA-126 表達水平，具體操作同1.3.2。

1.3.7Western blot檢測凋亡相關蛋白表達 轉染48 h，取各組對數生長期細胞，加入1 mL 蛋白裂解液（蛋白酶抑制劑：RIPA 裂解液=1∶1），置于冰上裂解30 min，12 000 rpm 離心5 min， 取上清轉移至新的離心管中，測定蛋白濃度。 配制分離膠和濃縮膠，取40 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，設置初始電壓為80 V，大約電泳30 min，見待溴酚藍指示帶到達分離膠時，調整電壓為120 V，繼續電泳2 h，直至溴酚藍指示帶電泳至分離膠底部。根據目的分子條帶切取凝膠， 并準備相應大小的硝酸纖維素膜，使用“三明治”夾轉膜，設置恒定電流200 mA，時間為1.5 h。 使用TBST 配制的5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，再分別加入一抗（PIK3R2、PI3K、PDK1、AKT、p -PI3K、p -PDK1、p -AKT、GAPDH）4℃孵育過夜，然后加入二抗孵育2 h；在避光條件下混勻ECL 化學發光液A 液和B 液，使用移液槍均勻地滴加至硝酸纖維素膜上，靜置5 min，曝光顯影，并置于顯影儀中拍照，采用凝膠圖象處理系統（Gel-Pro-Analyzer）軟件測定各蛋白灰度值，目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.3.8 裸鼠成瘤實驗 16 只BALB/c 裸鼠隨機分為過表達組和陰性對照組，轉染micRNA-126 mimics和micRNA-126 NC 的HepG2 細胞培養48 h，經0.25%胰蛋白酶消化液消化， 制成細胞密度為1×1013個/L 的細胞懸液， 取100 μL 分別從兩組裸鼠腋下注射，每組各8 只，每周測量裸鼠皮下腫瘤體積，計算公式為體積=[（腫瘤最長徑×腫瘤最短徑）]2×0.5，觀察6 周后處死小鼠，稱重。

1.3.9 生物信息學預測 采用miRwalk2.0（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）網站預測micRNA-126 可能的作用靶點。

1.3.10 micRNA-126 與PIK3R2 的靶向關系驗證采用熒光素酶實驗進一步驗證micRNA-126 與PIK3R2 的靶向關系， 體外合成含micRNA-126 與PIK3R2 3’ UTR 堿基互補區域的DNA 片段（WT）及含該位點突變體的DNA 片段（MUT），并克隆至雙熒光素酶啟動子載體， 將質粒轉染到micRNA-126 細胞和mimics 細胞，培養48 h，采用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.4 統計學方法 數據分析處理應用SPSS 20.0 統計學軟件進行，計量資料實驗結果采用（±s）表示，多組組間數據對比首先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗， 方差齊性采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組兩兩對比采用LSD 法，P<0.05，為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR 檢測micRNA-126 在肝癌細胞中的表達 通過檢測micRNA-126 在人肝癌細胞株HepG2、MHCC97-L、PLC、Huh7 以 及 人 肝 細 胞 株L02 中的表達，micRNA-126 在人肝癌細胞株HepG2、MHCC97-L、PLC、Huh7 中的表達水平顯著低于人肝細胞株L02 中的表達水平， 差異有統計學意義（P<0.05）。 見圖1。

圖1 micRNA-126 在人肝癌細胞和人肝細胞中的表達水平

2.2 RT-PCR 檢測轉染前后micRNA-126 表達水平的變化 RT-PCR 檢測結果顯示，micRNA-126 mimics 組HepG2、MHCC97-L 細胞中micRNA-126表達水平顯著高于control 組和micRNA-126 NC組，差異有統計學意義（P<0.05）。 見圖2。

圖2 轉染mimics 后HepG2、MHCC97-L細胞中micRNA-126 表達水平

2.3 MTT 法檢測過表達micRNA-126 對肝癌細胞增殖的影響 MTT 法檢測結果顯示，在24 h、48 h、72 h 以及96 h 時，micRNA-126 mimics 組HepG2、MHCC97-L 細胞增殖率均顯著高低于control 組和micRNA-126 NC 組，差異有統計學意義（F=12.167，F=6.771，F=17.073，F=38.671；F=17.182，F=18.590，F=12.604，F=32.876，P<0.05）。 見圖3。

圖3 MTT 法檢測過表達micRNA-126對肝癌細胞增殖能力的影響

2.4 流式細胞術檢測過表達micRNA-126 對肝癌細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，micRNA-126 mimics 組HepG2、MHCC97-L 細 胞 凋亡率均顯著高于control 組和micRNA-126 NC 組，差異有統計學意義（P<0.05）。 見圖4。

圖4 過表達micRNA-126 對肝癌細胞凋亡的影響

2.5 過表達micRNA-126 對裸鼠移植瘤生長的影響 過表達組裸鼠腫瘤體積顯著小于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。 見圖5。

圖5 裸鼠皮下成瘤模型腫瘤體積變化

2.6 micRNA-126 靶向抑制PIK3R2 蛋白表達并調控PI3K/PDK1/AKT 信號通路 micRNA-126 mimics 組PIK3R2、p-PI3K/PI3K、p-PDK1/PDK1、p-AKT/AKT 蛋白表達水平顯著低于control 組和micRNA-126 NC 組（P<0.05）。 見圖6。

圖6 Western blot 檢測PIK3R2、PI3K、PDK1、AKT、p-PI3K、p-PDK1、p-AKT 蛋白表達

2.7 肝癌細胞中PIK3R2 是micRNA-126 的靶基因 通過生物信息學預測工具 （miRwalk2.0 網站）發現，PIK3R2 是micRNA-126 的潛在靶點，micRNA-126 與PIK3R2 3’ UTR 區域堿基互補，PIK3R2為肝癌細胞中micRNA-126 的靶基因。 見圖7。

圖7 生物信息學預測PIK3R2 為micRNA-126 的靶基因

2.8 micRNA-126 與PIK3R2 的靶向關系 與轉染WT 熒光素酶質粒mimic NC 組相比， 共轉染WT熒光素酶質粒micRNA-126 mimic 組熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而轉染MUT 熒光素酶質粒mimic NC 組和共轉染MUT 熒光素酶質粒micRNA-126 mimic 組熒光素酶活性比較， 差異無統計學 意 義 （P>0.05），micRNA-126 可 靶 向 負 調 控PIK3R2。 見圖8。

圖8 熒光素酶實驗驗證micRNA-126 與PIK3R2 的靶向關系

3 討論

各種microRNAs 在肝癌中的發病機制中發揮著重要的作用，microRNAs 可通過調控其靶基因參與肝癌發生和發展。 MicroRNA-23a 可抑制肝癌細胞MHCC97H 細胞生長和增殖， 并通過下調KIAP誘導MHCC97H 細胞凋亡[9]。 Liu 等[10]證明microRNA-222 抑制劑靶向BBC3 抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲， 并抑制肝癌細胞凋亡。 Yu 等[11]發現miR-195 通過靶向YAP 來抑制肝癌細胞轉移和上皮間充質轉換。故microRNA 可能作為預測肝癌進展的新型生物標志物。

大量研究表明，micRNA-126 可能是多種腫瘤患者的調節因子和預后生物標志物[12-15]。 Nie 等[16]文獻報道指出， 與癌旁正常組織相比，micRNA-126 在食管鱗狀細胞癌組織中表達顯著降低，EC109 細胞中micRNA-126 過表達可抑制細胞增殖和遷移。 過表達micRNA-126 可抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲， 并可能通過調節PI3K/PDK1/AKT途徑誘導HeLa 細胞凋亡[17]。 Zhang 等[18]研究也表明，micRNA-126 在卵巢癌中顯著下調，micRNA-126 下調表達提示患者預后不良，其表達恢復則可明顯抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移，其可能與調節表皮生長因子樣結構域7 以及ERK/MAPK 信號通路和上皮間充質轉換有關。 本研究結果顯示，肝癌細胞中micRNA-126 表達水平顯著下調，與既往報道結果一致[19]。本研究中體外實驗結果發現，micRNA-126 過表達可顯著抑制肝癌細胞HepG2、MHCC97-L 細胞增殖，促進細胞凋亡，提示micRNA-126 可能是通過抑制肝癌細胞增殖和促進肝癌細胞凋亡影響肝癌發生和發展， 從而在肝癌細胞中發揮抑癌功能。 同時，裸鼠皮下成瘤模型實驗結果顯示，micRNA-126 過表達可明顯抑制裸鼠皮下腫瘤生長， 進一步證明micRNA-126 在肝癌中起著抑癌作用。 彭吉祥等[20]也認為，micRNA-126過表達可抑制肝癌細胞HepG2 細胞增殖、 遷移和侵襲能力，促進細胞凋亡，并抑制裸鼠皮下成瘤模型腫瘤生長。 故micRNA-126 可能是調控肝癌發生和發展的重要影響因素。

PIK3R2 編 碼PI3K 蛋 白，PI3K/Akt 信 號 通 路是與細胞生長密切相關的通路之一[21]。 PI3K 是由調控亞基（P85α、P85β、P85γ）和催化亞基（P110）組成的復合物，其產物PIP2 和PIP3 均是細胞內重要的第二信使，并在細胞增殖、凋亡以及代謝過程中發揮著重要作用[22]。 PI3K 被激活后，可使得細胞膜上的肌醇磷酸化，進而產生PIP3，PIP3 則與Akt 結合并使其活化， 活化的Akt 可調控細胞色素C 以及凋亡因子的釋放，最終抑制細胞凋亡[23]。 本研究通過生物信息學預測分析micRNA-126 可能的靶基因， 結果顯示，micRNA-126 與PIK3R2 3’ UTR區域堿基互補，PIK3R2 為肝癌細胞中micRNA-126 的靶基因。 進一步熒光素酶實驗驗證發現，micRNA-126 能夠抑制野生型PIK3R2 細胞活性，且并不抑制突變型PIK3R2 細胞活性，提示micRNA-126 可靶向負調控PIK3R2 表達。Western blot檢測結果顯示，micRNA-126 mimics 組PIK3R2、p-PI3K/PI3K、p-PDK1/PDK1、p-AKT/AKT 蛋白表達水平顯著低于control 組和micRNA-126 NC 組。提示micRNA-126 可能是通過與PIK3R2 mRNA 3’UTR 區域結合， 誘導PIK3R2 基因mRNA 序列降解， 從而抑制PIK3R2 蛋白合成， 從而抑制PI3K/PDK1/AKT 信號通路，最終促進肝癌細胞凋亡。 具體而言，一方面micRNA-126 通過作用于PI3K 抑制PDK1，使得AKT 磷酸化，進一步激活下游信號通路中GSK 3β、cyclinD 1、p70S6K 和S6， 最終調控細胞增殖； 另一方面micRNA-126 通過作用于PI3K 抑制PDK1， 使得AKT 磷酸化， 從而抑制Bad、Bcl-xL、Bax 以及激活Caspase-3/7， 最終促進細胞凋亡[24]。 Wu 等[25]研究也發現，micRNA-126 通過靶向PIK3R2 抑制骨肉瘤細胞增殖。 除此之外，有報道[26]指出，PLK-4 也可能是micRNA-126 的靶基因，miRNA-126/PLK-4 軸以及ATR/CHEK 1 通路的激活是肝癌發生和發展的關鍵，PLK-4/ATR/CHEK 1 通路可能是肝癌治療的潛在靶點。 總而言之， 這些研究為進一步理解肝癌發生和發展的機制提供了依據， 但micRNA-126 影響肝癌細胞生物學功能作用有待繼續深入研究。

綜上所述， 肝癌細胞中micRNA-126 下調表達，過表達micRNA-126 可抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌凋亡，抑制裸鼠皮下成瘤模型腫瘤生長，肝癌細胞中PIK3R2 是micRNA-126 的潛在靶基因，micRNA-126 可能靶向負調控PIK3R2 表達， 抑制肝癌細胞增殖及促進其凋亡， 可為進一步研究PIK3R2 在肝癌中的作用奠定理論基礎，對開發肝癌治療新藥具有一定指導意義。