不同稀釋介質對乙型肝炎病毒表面抗原定量檢測的影響

陳明心，王煒，張岱，任偉宏

（河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000）

在目前臨床檢驗工作中， 血清HBsAg 濃度已經可以使用全自動化免疫檢測系統進行檢測，但是很多檢測體系的檢測范圍（例如雅培）僅僅為<250 IU/mL，而在一些流行病學的調查中發現，很多乙肝患者的血清HBsAg 濃度能達到50 000 IU/mL的水平，甚至更高[1]。因此，需要將高濃度HBsAg 血清稀釋到檢測系統的線性范圍內進行檢測。 已有的研究發現[2-3]，不同的稀釋液介質會對稀釋后的檢測結果造成較大的影響， 而導致達不到稀釋檢驗基本要求，影響最終結果。

LiCA500 光激化學發光系統是一種較新的檢測系統，采用的是均相檢測方法[4-5]。 目前該系統對HBsAg 的檢測線性范圍只能達到500 μg/L 的水平，不能滿足對HBsAg 高濃度樣本檢測的需求，且試劑供應方未提供配套樣本稀釋液。 目前臨床常用稀釋液有生理鹽水和陰性血清，有研究報道，生理鹽水在其他免疫檢驗項目中稀釋效果不理想[6]。本研究嘗試探索尋找影響HBsAg 稀釋結果的主要成分，從而找到一種理想的HBsAg 定量稀釋液。

1 材料和方法

1.1 標本選取 選取LiCA500 上檢測HBsAg 為陽性的樣本50 份（HBsAg 血清濃度覆蓋0.2～500 μg/L 范圍）, 無明顯溶血、 脂血和膽紅素血； 另選擇HBsAg 濃度較高的病人血清（>500 μg/L）51 份，各自隨機尋找陰性血清將其進行稀釋配制成混合血清，該51 份混合血清濃度覆蓋0.2～500 μg/L 范圍。

1.2 稀釋液 選取四種稀釋液：（1）0.85%~0.90%的生理鹽水；（2）BSA， 可根據需要配制成不同濃度；（3）BGG，可根據需要配制成不同濃度；（4）隨機陰性血清（要求HBsAg 和HBsAb 同時為陰性）

1.3 儀器 光激化學發光全自動免疫分析儀器（Li-CA500，博陽公司）

1.4 試劑 LiCA500 配套HBsAg 檢測試劑，包含試劑A 和試劑B，以及LiCA 檢測系統共用通用液

1.5 實驗方法

1.5.1 不同稀釋介質對稀釋結果的影響 將101 份HBsAg 陽性樣本分別用生理鹽水，50 g/L BSA、15 g/L BGG 以及隨機陰性血清進行3 倍稀釋。 稀釋方法為病人血清30 μL +稀釋液60 μL，充分混合均勻后,使用LiCA500 檢測。按照試劑配套說明書，檢測過程為加入25 μL 樣本、25 μL 試劑A、25 μL 試劑B，反應15 min 后，加入175 μL 通用液，反應17 min 后，由儀器檢測發光值，再根據校準曲線自動獲得HBsAg 濃度， 將以上稀釋后得到的檢測結果乘以3， 得出通過稀釋后計算獲得的HBsAg 濃度（以C1 來表示），而未稀釋的原始樣本直接檢測的濃度以C2 表示，根據CLSI EP7-A2 文件使用公式計 算 稀 釋 檢 測 帶 來 的 偏 差：D=|（C1- C2）/ C2|100%，設定D 在20%以內為合格，觀察各稀釋組有多少結果可以達到合格。

1.5.2 同一蛋白稀釋介質不同濃度對稀釋結果的影響 選取10 份HBsAg 陽性樣本 （其濃度覆蓋0.2~500 μg/L 范圍），分別用80 g/L、60 g/L、40 g/L、10 g/L 的BSA，以及20 g/L、15 g/L、10 g/L、5 g/L 的BGG 進行稀釋， 將不同濃度BSA 以及不同濃度BGG 稀釋后得到的結果分別除以未稀釋時的相應的原始檢測結果， 得出稀釋3 倍后的檢測結果相對于未稀釋檢測結果的降幅， 對不同濃度的同種基質的稀釋液之間的稀釋結果進行相關分析。 并將其分析結果進行比較。

1.5.3 動力學分析 選取15 份HBsAg 陽性樣本（其濃度覆蓋0.2~500 μg/L 范圍） 分別用生理鹽水、50 g/L BSA、15 g/L BGG、 以及陰性血清稀釋3倍，稀釋后上機進行檢測，在加入通用液后，分別將孵育時間控制在17 min （總反應時間為32 min）、47 min（總反應時間為62 min）、62 min（總反應時間為77 min） 和77 min （總反應時間為92 min） 進行檢測。 并分別用總反應時間62 min、77 min 和92 min 時測得的發光信號值除以總反應時間32 min 時測得的發光信號值，計算各自的增幅。

1.5.4 統計分析 使用統計軟件SPSS 24.0 進行統計分析， 不同稀釋介質對101 例樣本稀釋結果采用單因素方差分析，并用LSD 法做兩兩比較。 同一種蛋白不同濃度稀釋結果采用回歸分析。 動力學結果，不同介質稀釋組92 min 相對于32 min 的增幅采用單因素方差分析，并用LSD 法做兩兩比較。

2 結果

不同稀釋液稀釋后偏差在20%以內的樣本例數見圖1。15 g/L BGG 稀釋后偏差在20%以內者最多。 各不同稀釋液稀釋所得回收率偏差結果如圖2，通過單因素方差分析，非混合樣4 組稀釋結果的F為35.830，P為0.000，混合樣4 組稀釋結果的F為91.706，P為0.000，說明無論混合樣本還是非混合樣本，4 組稀釋得到的回收率偏差整體均有顯著性差異，進一步做LSD 檢驗，15 g/L BGG 和生理鹽水組以及50 g/LBSA 組均有顯著性差異，無論是非混合樣本還是混合樣本均是15 g/L BGG 稀釋所得回收率偏差最小。

圖1 不同稀釋組回收率偏差小于20%的樣本所占比例

圖2 101 例樣本經4 種稀釋液稀釋后回收率偏差的對比

對BSA 不同濃度與各濃度稀釋后的降幅之間進行相關分析， 其相關系數為-0.088，P為0.589，無明顯差異； 對BGG 不同濃度與各濃度稀釋后的降幅之間進行相關分析， 其相關系數為-0.744，P為0.000，有明顯差異。 當BSA 作為擁擠分子時隨著稀釋液中BSA 濃度的增加， 結果僅僅出現了輕度的下降，并未出現明顯大幅度的改變。當BGG 作為擁擠分子時隨著稀釋液中BGG 濃度的增加， 從5 g/L 增加至20 g/L 時， 稀釋結果下降了接近50%。見圖3。

4 組稀釋液對樣本進行3 倍稀釋后， 62 min、77 min、92 min 各自相對32 min 的增幅見圖4。 在77 min 至92 min 時間段的增幅較為接近， 從而認為在92 min 時，抗原抗體結合反應接近達到平衡，本次研究擬將92 min 作為反應平衡點。 4 個稀釋組92 min 相對于32 min 的增幅，見圖5，通過單因素方差分析，F為27.358，P為0.000， 說明4 組在92 min 得到的增幅整體有差異， 進一步進行LSD 檢驗，15 g/L BGG 組和其他組之間均有明顯差異，結合圖3 所示，可以看出在92 min 時，生理鹽水稀釋組和50 g/L 稀釋組的增幅接近，15 g/L BGG 稀釋組的增幅是最大的。

圖4 HBsAg 陽性樣本經4 種稀釋液稀釋后延長反應時間相對反應32 min 增幅

圖5 不同稀釋組92 min 相對于32 min 的增幅

3 討論

目前已經證實， 在稀釋液中存在的各種反應成分以外的基質成分會對反應速度造成影響，通常將這些基質成分稱為擁擠分子[7]，稀釋液中的擁擠分子如果足以改變抗原抗體反應的速度， 則可能造成HBsAg 稀釋結果的不準確。 血清中含量最多的成分是蛋白質，濃度可達到60~80 g/L，由此推測， 有可能是血清中其他蛋白質作為擁擠分子對HBsAg 和其抗體結合速度造成了影響。 血清蛋白質主要成分為白蛋白和γ 球蛋白，還有少部分的α球蛋白和β 球蛋白， 因此分別選擇BSA 和小牛血清γ 球蛋白作為稀釋液成分， 模擬人血清不同種類蛋白質來觀察其對稀釋效果的影響。 由于人血清中白蛋白含量[8]約為40~60 g/L，平均濃度為50 g/L，因此將BSA 稀釋液濃度控制在50 g/L。人血清中IgG 含量[9]約為為8~16 g/L，平均濃度約為12 g/L，而血清中IgG 含量約占γ 球蛋白的80%，因此將BGG 稀釋液濃度控制在15 g/L。 為了更好地證明稀釋液的稀釋效果，除了隨機選取了50 例在0~500 ng/L 的HBsAg 陽性樣本外， 還將較高濃度的HBsAg 陽性血清用其他陰性血清進行稀釋配制成混合血清， 將混合血清濃度稀釋在0.2~500 μg /L的范圍內。 一份混合血清往往代表了兩到三份樣本的綜合情況，可更好地減弱一些隨機基質效應。從本次實驗的結果看， 相對分子量較小的BSA 和生理鹽水的稀釋效果接近， 回收率偏差遠不能達到預期。 而相對分子量較大的BGG 則稀釋效果較好， 近80%的樣本可以達到80%~120%范圍以內。陰性血清稀釋效果出現了較大差異。

將BSA 和BGG 的梯度拉開后，BSA 不同濃度的稀釋液稀釋結果相差不大， 濃度達到80 g/L 后略有下降。 而BGG 濃度從5 g/L 增加至20 g/L 時，稀釋結果下降了約50%。 由此，可認為模仿人γ 球蛋白的BGG 在稀釋過程中是影響稀釋效果是否能夠符合預期的主導影響因素。 造成該種現象的原因可能是，γ 球蛋白由于分子量較大， 因此是血液粘度的主要決定因素[10-11]。 而血液粘度決定了分子的擴散受到的摩擦力從而影響擴散速度, 且血清中的HBsAg 大多不是單純的游離形式存在的蛋白，而是病毒小圓顆粒表面的蛋白質[12],大顆粒物質更容易受到摩擦力的阻滯作用， 導致抗原抗體相遇的速度更慢。作為對比，蛋白成分BSA 并非影響分子擴散的主要影響因素。

為了進一步驗證BGG 對擴散的影響。 本次實驗進一步進行了動力學觀察。 針對不同稀釋液稀釋的樣本， 采用增加孵育時間的方法觀察其檢測結果的變化。 如果是影響擴散的情況下，則在較早的時間點中，抗原抗體相遇較少，形成的復合物也較少，但是抗原抗體的總量并未發生變化，只是結合速度發生了改變，因此延遲孵育時間，使其能夠充分結合而達到反應平衡之后， 則在第一次檢測到達到反應平衡這段時間中BGG 稀釋的樣本會有更多的抗原抗體復合物形成， 因此其增幅與生理鹽水稀釋樣本以及BSA 稀釋樣本相比明顯較大，與隨機選取的陰性血清相比也較大， 這可能和陰性血清稀釋結果不穩定的情況有關， 里面可能還會存在一些未知因素的干擾， 這些仍需進一步研究。 由以上推測，BGG 稀釋組中HBsAg 和其抗體的整體擴散速度應低于生理鹽水稀釋組和BSA 稀釋組，BGG 可能具備和血清中γ 球蛋白較為接近的控制HBsAg 和其抗體擴散的能力， 從而得到了較好的HBsAg 定量稀釋結果。