晚期非小細胞肺癌組織中AURKA 表達與含鉑化療療效及預后的關系

馬改玲，吳博通，劉孟孟，張俊濤

（1.登封市人民醫院病理科，河南 登封 452470；2.登封市人民醫院腫瘤科，河南 登封 452470）

肺癌是一種高發病率和高死亡率的惡性腫瘤，據報道是中國死亡率最高的癌癥，其中非小細胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）幾乎占所有肺癌病例的85%， 大部分患者在確診時已處于晚期[1]。 化療是這些患者的主要治療選擇之一，盡管廣泛使用化學療法， 例如鉑類藥物， 晚期NSCLC 患者的預后仍然很差，5 年生存率始終低于15%[2-3]。 AURKA 是一種細胞周期調節激酶，參與中心體成熟、有絲分裂進入、雙極紡錘體組裝和染色體分離，在許多癌癥類型中經常有報道AURKA表達升高[4]。 AURKA 單獨或與其他因素聯合可引發細胞惡性轉化并促進癌細胞的惡性表型[5]。 AURKA 通過調節多種致癌和抑癌蛋白顯示致癌活性：AURKA 在Ser215 和Ser315 處對磷蛋白p53腫瘤抑制蛋白（Tumor protein p53，TP53）的磷酸化分別通過鼠雙微體2 基因（Murine doubleminute 2，MDM2）介導的泛素化和TP53DNA 結合/反式激活活性的消除導致TP53 降解[6]。反過來，TP53 下調會增加ARUKA 在轉錄和翻譯后水平的表達[7]。 AURKA 和TP53 之間的負反饋調節極大地促進了致癌作用和進展。較低的AURKA 表達會提高對化療（如紫杉醇或多西他賽）的敏感性，并降低對鉑的耐藥性[8]。 相比之下，AURKA 的過度表達可以降低順鉑敏感性和對抗微管藥物的抵抗力[9]。 目前，尚未見關于AURKA 表達對晚期NSCLC 患者鉑類化療療效及預后作用的研究報道。 本研究擬評估AURKA 表達與晚期NSCLC 患者鉑類化療反應和預后的關系，為晚期NSCLC 的治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2016 年1 月至2018 年6 月登封市人民醫院90 名經組織學證實為晚期NSCLC的患者納入研究。 所有活檢樣本均通過支氣管鏡或細針抽吸活檢收集。 所有患者均在本院腫瘤科接受了鉑類聯合化療。 5 年內有其他惡性腫瘤病史、懷孕或哺乳期、嚴重感染或器官功能受損者除外。獲取組織后作石蠟切片以及IHC 染色切片。所有患者在納入研究前均簽署知情同意書， 該研究獲得本院醫院倫理委員會的批準。

所有患者均接受鉑類化療作為一線化療，如吉西他濱、 長春瑞濱或紫杉醇。 在第1 天和第8天， 靜脈給藥劑量為75 mg/m2順鉑、1 000 mg/m2卡鉑和吉西他濱和25 mg/m2長春瑞濱， 最多4 個周期， 暫停治療直至疾病進展或出現不可接受的毒性。 如果患者出現三級非血液學毒性、四級血液學毒性、發熱性中性粒細胞減少或感染，則下一個周期的化療藥物劑量減少25%。 化療結束后，每月對患者進行電話隨訪，直至死亡或研究結束。 通過使用實體瘤反應評估標準（RECIST）對化療反應進行分類：分為完全緩解（Complete remission，CR）、部分緩解（Partial remission，PR）、疾病穩定（Stable disease，SD） 以及疾病進展 （Disease progression，PD），有效＝CR＋PR，無效＝SD＋PD。

1.2 免疫組化法測定AURKA 表達及判定標準 本研究使用從手術切除中獲得的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織的4 μm 厚切片。 將切片固定在載玻片上， 然后與抗AURKA 的抗兔單克隆抗體（Abcam，Cambridge，UK） 一起孵育， 使用Bench Mark XT（Ventana Automated Systems，Inc，Tucson，AZ，USA）進行免疫組織化學分析。使用Ventana 的CC1 修復溶液對每張載玻片進行熱處理30 min，然后與AURKA 抗體一起孵育30 分鐘。 該自動化系統使用以3,3'-二氨基聯苯胺(DAB)作為色原的Ultra VIE WDAB 檢測試劑盒 （Ventana 自動化系統）。 評分是包括陽性染色腫瘤細胞的比例和染色強度。癌細胞百分比評分如下：陽性癌細胞<10%的切片評分為0； 陽性癌細胞10%~50% 的評分為1； 陽性癌細胞50%~75% 的評分為2；且＞陽性癌細胞75%的評分為3。 同時，根據染色強度將組織分為四個等級：0 表示無染色； 1 表示染色較弱（淺黃色），2 表示中度染色 （黃褐色），3 表示強染色（棕色）。 染色指數（0~9）計算為陽性癌細胞比例乘以染色強度評分的乘積。 最佳截斷值定義如下：染色評分> 6 被認為具有陽性AURKA 表達，染色評分為≤6 表明陰性AURKA 表達。

1.3 統計分析 使用統計軟件包SPSS 21.0（IBM）進行數據處理，分類變量以百分比(%)描述，并使用χ2檢驗分析，采用多因素Logistics回歸分析探討晚期非小細胞肺癌患者化療療效相關因素， 多因素Cox回歸分析晚期非小細胞肺癌患者總體預后相關因素，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 晚期非小細胞肺癌組與癌旁組AURKA 蛋白表達比較 AURKA 呈黃色或深棕黃色顆粒， 定于細胞核，晚期非小細胞肺癌組AURKA 蛋白表達陽性率高于癌旁組（P<0.05）。 見表1。

圖1 晚期非小細胞肺癌組與癌旁組AURKA 蛋白表達（HE 染色，400x）

表1 晚期非小細胞肺癌組與癌旁組AURKA 蛋白表達比較［n（%）］

2.2 晚期NSCLC 患者臨床病理特征與化療療效的關系 晚期NSCLC 患者化療療效與年齡、 性別不相關（P>0.05）；與腫瘤最大徑、TNM 分期、浸潤深度、AURKA 表達、病理級別、淋巴結轉移、復發相關性明顯， 且腫瘤最大徑大于或等于5 cm、TNM分期高、浸潤深度深、AURKA 表達陽性、病理級別低、有淋巴結轉移、有復發，晚期NSCLC 患者化療無效率高（P<0.05）。 見表2。

表2 晚期NSCLC 患者臨床病理特征與化療療效的關系［n（%）］

2.3 晚期NSCLC 患者化療療效影響因素多因素Logistics回歸分析 以化療療效為因變量（0=有效，1=無效），表2 單因素分析有意見的變量進行多因素Logistics回歸分析， 結果顯示，TNM 分期Ⅳ期、病理級別低、AURKA 表達陽性是影響晚期NSCLC患者化療療效的危險因素（P<0.05）。 見表3。

表3 晚期NSCLC 患者化療療效多因素Logistics 回歸分析

2.4 晚期NSCLC 患者預后生存情況 本研究90例晚期NSCLC 患者中， 自出院后至隨訪結束存活4～60 個月，2 年生存率為58.9%（58/102）； 其中AURKA 陽性和陰性患者2 年總生存率分別為40/72（55.6%）和18/18（100.0%）；AURKA 陽性的晚期NSCLC 患者2 年生存率相較于陰性患者顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 影響晚期NSCLC 患者預后單因素分析 經單因素分析得出： 腫瘤最大徑≥5 cm、TNM 分期Ⅳ、浸潤深度≥6 cm、 有淋巴血管間隙浸潤、 化療無效、病理級別低、有復發、AURKA 陽性的晚期非小細胞肺癌患者2 年生存率均顯著縮短（P＜0.05），見表4。

表4 影響晚期NSCLC 患者預后的單因素分析

表5 晚期NSCLC 患者總體預后影響因素的多因素Cox 回歸分析

2.6 晚期NSCLC 患者總體預后影響因素的多因素Cox回歸分析 以晚期NSCLC 患者總體預后為因變量（1=死亡，0=生存），以表4 單因素分析有意義變量為自變量進行多因素Cox回歸分析， 結果顯示：化療無效、TNM 分期Ⅳ期、AURKA 表達陽性是影響晚期非小細胞肺癌患者預后的獨立危險因素（P<0.05）。

3 討論

多項臨床研究評估了AURKA 在18 種腫瘤組織和匹配的正常組織中的表達，結果表明，與正常組織相比，AURKA 在大多數測試的癌癥類型中表達上調[10]。 臨床研究表明，較高的AURKA 與大多數癌癥類型（結腸癌、肝癌、前列腺癌）的預后不良相關。一項研究評估了結直腸癌患者中AURKA 的預后作用，盡管缺乏統計學意義，但其結果仍然提示AURKA 可能對生存有積極影響，并強調有必要研究AURKA 對治療反應的影響，該研究的進一步體外細胞試驗研究表明[11]，轉錄因子的甲基化不足和上調可能至少部分導致結腸癌中AURKA 的表達升高。 一些研究表明，基因擴增是AURKA 升高的另一個原因[12]。通過反式激活DNA 損傷反應(DDR)基因來維持基因組穩定性是AURKA 依賴性腫瘤促進的關鍵介質； 因此，AURKA 過表達會導致各種DDR 機制的喪失，從而促進基因組不穩定性和癌癥的發展[13]。 本研究結果顯示：晚期非小細胞肺癌組AURKA 蛋白表達陽性率高于癌旁組，AURKA 陽性的晚期NSCLC 患者2 年生存率均顯著縮短，AURKA 表達陽性是影響晚期NSCLC 患者預后的獨立危險因素。 這說明，AURKA 在晚期NSCLC 過表達，AURKA 表達陽性是影響晚期NSCLC 患者預后的獨立危險因素。 近期研究發現，鉑誘導的DNA 損傷可觸發DNA 損傷修復（DDR）， 這是對鉑產生化學抗性的主要因素，而AURKA 能促發DDR， 此外癌癥中上調的AURKA可能促進癌癥進展，這可能是AURKA 陽性的晚期NSCLC 患者2 年生存率均顯著縮短的原因。

DNA 是許多抗癌藥物的分子靶點。 修復DNA的異常能力與化療耐藥密切相關， 這可能極大地影響化療的有效性。 為了提高化療的療效并降低其毒性， 根據化療相關基因的表達水平或多態性來定制化療，AURKA 是一個位于染色體片段17q12-21 的100kb 區域，在修復雙鏈DNA 斷裂和順鉑耐藥介導的DNA 損傷中起著重要作用[14]。 先前的研究報道，在AURKAmRNA 表達的最高三分位數與對輔助化療的反應增加之間發現了顯著的相關性[15]。 AURKA 低表達與對順鉑和依托泊苷更好的敏感性相關；此外AURKA 低表達與抗微管藥物有關，如紫杉醇、多西他賽和長春瑞濱[16]。研究報道，根據AURKA 表達的差異，當專門使用吉西他濱時， 可以大大提高其療效。 目前的研究支持AURKA 通過促進基因組不穩定性參與結腸癌變，增加的AURKA 為基于DNA 損傷誘導藥物的化療抗性提供依據[17]。已經在不同的癌癥類型中研究了AURKA 對化學敏感性的影響。 到目前為止，其結論一致，AURKA 損害了化學敏感性[18]。本研究結果發現， 晚期NSCLC 患者化療療效與腫瘤最大徑、TNM 分期、浸潤深度、AURKA 表達、病理級別、淋巴結轉移、復發相關性明顯，且腫瘤最大徑≥5 cm、TNM 分期越高、浸潤深度越深、AURKA 表達陽性、病理級別低、有淋巴結轉移、有復發，晚期非小細胞肺癌化療無效率越高（P<0.05）。 TNM 分期Ⅳ期、病理級別低、AURKA 表達陽性是影響NSCLC 患者化療療效的獨立危險因素 （P<0.05）。 這提示，AURKA 高表達的NSCLC 患者在接受鉑類化療時表現出更差的反應和更短的進展時間。 體外細胞實驗表明[19]，抑制AURKA 可增強癌細胞對紫杉烷和紫杉醇、順鉑、多柔比星和5-氟尿嘧啶(5-Fu 的化學敏感性；而AURKA 在各種癌癥中抑制鉑化學敏感性，包括卵巢癌、肝細胞癌、髓母細胞瘤、急性髓系白血病以及頭頸癌。 細胞機制研究發現[20]，在癌細胞亞群中，AURKA 沉默通過上調抗凋亡因子使結直腸癌干細胞(CR-CSC)對奧沙利鉑的反應敏感增強。本研究未探討AURKA 對晚期非小細胞肺癌化療敏感性抑制的機制，這將在后續研究中進行。

綜上所述，晚期非小細胞肺癌組織中AURKA表達水平升高；高水平的AURKA 是晚期非小細胞肺癌患者含鉑化療不敏感及預后不良的危險因素。