蛋白質組學技術在速凍食品中的應用研究進展

黃姍，時文六，白天，縱偉

（1.河南省食品和鹽業檢驗技術研究院，河南 鄭州 450000；2.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000）

蛋白質組是指一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質。蛋白質組學是指以蛋白質組為研究對象，從整體的角度，分析細胞內動態變化的蛋白質組成與變化規律的科學[1]。蛋白質組學不僅僅在動物[2]、植物[3]和微生物[4]等生物學科中得到發展，而且在食品工業中得到廣泛應用[5-6]。近年來，速凍食品產業在我國得到快速發展，速凍食品加工過程中，通過蛋白質組學方法，了解原料中蛋白質在加工過程中的組成、數量及其功能特性的變化，了解環境中微生物對速凍食品的影響[7-8]，對控制速凍食品的質量和安全具有重要作用。本文對蛋白質組學的基本技術及其在速凍食品中的應用現狀進行綜述，并對未來的發展進行展望，以期為進一步擴大蛋白質組學在速凍食品中的應用提供參考。

1 蛋白質組學研究過程中的主要技術

1.1 蛋白質提取技術

蛋白質提取首先是進行勻質化，然后采用適宜的溶劑對蛋白質進行溶解提取。目前，蛋白質勻質的方法有機械法、超聲法、液氮研磨、熱處理和凍融法等[9-10]。如，Kielkopf 等[11]為有效提取大腸桿菌中的蛋白質，采用液氮研磨和超聲處理裂解大腸桿菌，有利于后期的提取操作。

對勻質后的蛋白質，需要采用適宜的溶劑體系將其從原料中提取出來。對于理想的提取溶劑體系，不僅要對蛋白質有較強的溶解性，而且要防止被提取的蛋白質變性，提取后要容易去除。目前，常見的蛋白質提取溶劑體系有尿素、十二烷基磺酸鈉、三羥甲基氨基甲烷/酚等[12]，如，郭小蛟等[13]分別采用離心-超聲波破碎法和液氮研磨-超聲波破碎法對濃香型白酒酒醅樣品進行預處理后，采用三羥甲基氨基甲烷/酚提取、甲醇/醋酸銨沉淀提取微生物蛋白質，優化了酒醅微生物蛋白質的提取方法。近年來，一些研究者還在探索新的溶劑提取體系，如，Rufino 等[14]以離子液體形成雙水相，萃取分離牛血清白蛋白，并優化了提取條件，在最優條件下，牛血清白蛋白的回收率和純度較高，且原有的二級結構在提取過程中未破壞。與有機溶劑相比，離子液體具有熔點低、化學穩定性高、溶解能力強、結構可調等特性，因此，蛋白質提取的離子液體溶劑體系的研究，仍是未來的研究熱點。

1.2 蛋白質分離技術

提取后的蛋白質，由于其中含有大量雜質，需要進行進一步分離純化，目前常用的方法有雙向凝膠電泳、雙向熒光差異電泳、毛細管電泳和高效液相色譜等方法。

雙向凝膠電泳基于等電點的差異進行等電聚焦電泳分離，再根據蛋白質分子質量的差異，在垂直方向進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）二次分離，該方法分離效果好、重復性強。如，Sandhya 等[15]為分析苔蘚中蛋白質組成，采用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸提取、三氯乙酸-丙酮沉淀的方法得到粗蛋白質，然后采用雙向凝膠電泳進行分離，苔蘚蛋白得到有效分離。雙向凝膠電泳分離效果好，但其無法實現自動化連續分離。

毛細管電泳是通過在高電場強度下，對毛細管中的待測蛋白進行分離的方法，根據分離原理不同，可分為毛細管區帶電泳、毛細管等電聚焦和SDS-毛細管電泳等。如，Omar 等[16]對歐洲單峰駱駝乳中的蛋白[α-乳清蛋白（α-lactalbumin，α-Lac）、乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）、β-酪蛋白（β-casein，β-CN）和α-酪蛋白（α-casein，α-CN）]進行分離，發現毛細管電泳可實現有效分離。

對于分子量小、豐度低、成分復雜的蛋白質，雙向凝膠電泳和毛細管電泳分離都存在一定的困難，高效液相色譜對該類蛋白質具有較好的分離效果，已成蛋白質組學研究的主要手段。如，成希飛等[17]采用反相高效液相色譜對廣東水牛乳乳清蛋白成分進行了分離和定量分析研究，研究發現采用反相高效液相色譜可將乳清蛋白中α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）3 種主要成分有效分離。

由于目前單一的分離方法都存在一定的局限性，因此，根據蛋白質物理、化學和生物學特性的差異，將多種分離方法集成應用，在保持蛋白質生物學特性的基礎上，對蛋白質高效分離的方法將是研究者關注的熱點。

1.3 蛋白質鑒定技術

目前，蛋白質的鑒定技術包括傳統的蛋白質鑒定技術[18]、肽質量指紋譜蛋白質鑒定技術[19]、蛋白芯片[20]和質譜技術（mass spectrum，MS）[21]等。

傳統的蛋白質鑒定技術主要采用Edman 降解法和氨基酸成分分析法。Edman 降解法時間長、費用高，氨基酸成分分析法速度慢、需要樣品數量大；肽質量指紋譜蛋白質鑒定技術根據樣品水解后的肽段形成的反映肽段序列、肽混合物質量數的指紋圖譜，在蛋白質數據庫中進行檢索、匹配、分析。但由于在制備或加工過程中，樣品會與所用化學試劑產生修飾反應，會導致匹配存在一定的誤差；蛋白芯片是將一個蛋白質家族所有成員或者一種蛋白質的所有變異體固定在特定固相載體的表面，形成一種蛋白識別分子（抗體）或蛋白樣品的微陣列傳感片，該法靈敏度高、特異性強，適用于大通量的蛋白質篩選。質譜技術是將蛋白質、多肽樣品進行分子離子化后，通過測定不同離子的質荷比來確定相對分子質量，并通過分析碎片離子，獲得氨基酸序列和翻譯后修飾物。如，宋天園等[22]采用高效液相色譜復合四極桿軌道阱質譜法對柏樹花粉中的主要過敏原蛋白進行分析和鑒定，應用溶劑法提取圓柏花粉中的蛋白，經酶切、前處理和色譜分離后，采用復合四極桿軌道阱質譜對蛋白進行分析，檢測出37 種蛋白，獲得花粉中豐富的蛋白和肽段信息，該方法具有較高的靈敏度和分辨率；金萍等[23]在對大閘蟹蛋白提取方案、質譜參數優化的基礎上，采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法建立了陽澄湖大閘蟹組織蛋白分子指紋圖譜，為產地鑒別分析建立了條件。MS 法準確、特異、靈敏、高通量，是目前蛋白質組學鑒定最有效的方法。

1.4 生物信息學分析技術

采用凝膠雙向電泳、蛋白芯片和質譜等手段獲得大量蛋白、多肽的數據后，目前形成了一些蛋白質組數據庫，如SWISS-PROT 、WORLD-2D PAGE 等。這些蛋白質組數據庫包含需要鑒定的蛋白質信息，如結構[蛋白質的順序、核苷酸順序、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2DPAGE）、三維聚丙烯酰胺凝膠電泳（three-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，3D-PAGE）]、翻譯后的修飾、基因組及代謝數據庫等。需要對這些數據進行生物信息學分析，目前蛋白質組學進行的生物信息學分析主要是基因本體分析[24]、京都基因分析[25]、基因組百科全書分析[26]、聚類分析和蛋白互作分析[27]。但由于這些數據復雜、高通量，要進入數據庫進行檢索，需要由相關的軟件對數據進行處理，目前，一些新的軟件不斷得到開發。如對2D-PAGE 進行斑點檢查與量化、背景過濾、圖像匹配與比較及統計分析的軟件，對蛋白質結構信息進行比對和結構預測的軟件，如SEQUEST、MS-Fit 和Findmod 等[28]。這些軟件的應用，都是蛋白質信息分析的重要手段。今后，生物信息學數據庫的建立和應用軟件的開發仍將得到持續關注，將蛋白質鑒定和生物信息學分析相結合，建立高通量、大規模、自動化的鑒定復雜蛋白質樣品的方法，如何實現快速、準確地篩選功能蛋白質是研究者關注的熱點。

2 蛋白質組學技術在速凍食品中的應用

2.1 在速凍食品原料種類鑒別中的應用

速凍食品的品質與其原料的品質密切相關[29]，因此，速凍食品的原料種類鑒別對控制原料質量具有重要作用。Buckley 等[30]采用固相萃取方法對不同品種的羊肉中的多肽進行純化，采用基質輔助激光解吸附串聯質譜技術（matrix assisted laser desorption ionization，MALDI-MS/MS） 對來自綿羊和山羊膠原蛋白的33 種氨基酸進行多肽測序后發現，綿羊和山羊兩個物種之間存在2 條氨基酸序列的差異，可用于區分喜馬拉雅塔爾羊與羱羊等不同品種；魚類是速凍魚丸、魚排等產品的主要原料，張九凱等[31]對大西洋鮭、大馬哈魚和虹鱒中的蛋白質進行提取、胰蛋白酶消化后，采用超高效液相色譜-串聯三重四極桿飛行時間質譜法進行分離鑒定，通過與Uni Prot 蛋白質數據庫對比分析，篩選得到這3 個物種的7 條特征肽段，為3 種魚類的品種鑒別建立了有效的方法。牛肉的原料特性對相應的速凍食品產生重大影響，通過蛋白質組學研究，牛肉中的一些特定蛋白質組分與牛肉的水分流失、色澤、彈性等品質密切相關。Myosin（MY）是在牛肉中存在的一個蛋白質家族，其包括MY1、MY2、MYPF 和MY6B 等，MY 在牛肉的品質控制中起到重要的作用[32]。De Souza Rodrigues 等[33]通過蛋白質組學分析了內羅畢（Nellore）和安格拉（Angus）牛的腰部肌肉，發現內羅畢牛的腰部肌肉中蛋白組分MY 的輕鏈部分MYL1 含量顯著高于安格拉牛，這是兩種牛肉具有不同品質的重要原因。同一類的食品原料，由于產地、季節、種（養）植時間等因素不同，原料的品質會產生一定的差異。今后，采用蛋白質組學研究產地、季節、種植（養殖）時間等對原料品質的影響將是研究者關注的熱點。

2.2 在速凍食品原料摻假鑒別中的應用

在速凍食品生產過程中，摻假成為消費者關心的熱點問題，如速凍羊肉卷中添加鴨肉、速凍牛肉丸中添加豬肉等。因此，食品科學工作者一直在研究速凍食品原料摻假的檢測方法[34]。但傳統的感官、形態、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）等方法很難實現鑒別。近年來，研究者開發了蛋白質組學、聚合酶鏈式反應和光譜分析等技術[35]，其中蛋白質組學技術受到關注。如，Montowska 等[36]將山羊肉、綿羊肉等原料混合成為16 種肉糜，采用2D-PAGE 和非膠分級分離電泳結合MS 技術，從肌球蛋白輕鏈MLC1 和MLC2 中獲得了特異性的肽段，由此可實現檢測不同肉類中的摻假量；蒲科源等[37]為構建高通量、快速、經濟的牛肉摻假鑒別方法，采用生的和熟的牛、雞、鴨、豬4 種肉進行蛋白質提取，采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜采集得到離子峰，采用隨機森林算法得到11 個區分不同肉的特征蛋白質，結合主成分分析和數據可視化方法，構建了牛肉摻假鑒別模型；Stachniuk 等[38]為鑒別豬肉、雞肉和羊肉摻假兔肉，采用液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜（liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry-mass spectrometry，LC-QTOF-MS/MS）方法對純兔肉及含有5%～85%的兔肉與其他常見的肉類（豬肉、雞肉和羊肉）的混合樣進行分析，從肌原纖維蛋白和肌漿蛋白中鑒定了49 種特異性多肽，鑒別肉類是否含有兔肉成分。Yuswan 等[39]采用化學計量學輔助鳥槍蛋白質組學對豬肉、牛肉和雞肉進行肽標記，通過肽質量指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF）分析鑒定肽標記，采用偽裝、隨機和串聯的數據庫搜索程序MS-Fit 和MS-Tag 進行分析，區分相應的肉的比例。

目前，肉類原料摻假主要是采用凝膠電泳結合質譜技術進行鑒別，但該類方法還存在一定的局限性，一是采用凝膠進行蛋白（多肽）分離時，蛋白（多肽）的分子量要適宜，過大或過小都不易分離，二是在蛋白（多肽）中明確特異性標記蛋白（多肽）難度較大[39]。如何克服這兩方面的缺陷，是今后原料摻假鑒別中亟需解決的問題。

2.3 在速凍食品微生物安全控制中的應用

微生物的分布和數量對速凍食品的安全具有重要影響，一些微生物在低溫冷凍、高溫、高壓等極端條件下，能夠針對外界條件進行響應，導致其蛋白質產生相應的響應，因此，采用蛋白質組學技術可了解其微生物的變化情況。如，Mihoub 等[40]研究了冷凍條件下兩種大腸埃希氏菌I2 與R3 的生存情況，采用2DPAGE 分離出不同冷凍條件下微生物細胞質和外膜上的蛋白，并且利用質譜進行鑒定，發現I2 與R3 對冷凍的耐受能力不同，R3 具有更好的冷凍耐受能力，冷適應導致了某些蛋白質表達的變化，在R3 菌株中發現延長因子EF-TU 在外細胞膜上的過度表達，鞭毛素蛋白FLIC 在細胞質中表達量下降；趙曉策等[41]采用表面增強激光解析電離飛行時間質譜技術分析冷鮮灘羊肉貯藏中微生物菌體蛋白質及變化規律，采用氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀分析其代謝產物及變化規律，采用主成分分析法及熱力圖分析法對菌體蛋白質差異與代謝產物之間的關聯性進行分析，發現灘羊肉在貯藏過程中微生物的菌體蛋白質變化對代謝通路產生影響，導致形成不同代謝產物；Fuertes-Perez 等[42]在肉類模擬培養基中，監測不同氣體對肉食發光桿菌和磷酸假單胞菌生長的影響，并在指數增長期間采集樣本進行蛋白質組學分析。發現發光細菌不感知環境中二氧化碳的水平，而是適應自身的厭氧代謝。在厭氧條件下，二氧化碳對發光細菌生長的調節是有限的，并且只對特定菌株有效；Zhao 等[43]將蛋白質組學與代謝組學相結合，用于豬肉分泌物的新鮮度研究，測定了不同溫度（25、10、4、-2 ℃）下儲藏的豬肉分泌物中肽類和代謝產物的變化，鑒定了來自7 種蛋白質和30 種代謝產物的肽，發現它們在新鮮豬肉和變質豬肉之間的豐度不同。豬肉品質與這7 種蛋白和30 種代謝產物的多肽之間存在顯著相關性，并提出這種變化可作為判斷豬肉是否腐敗變質的標志。

由于速凍食品的安全性是消費者關注的熱點，利用蛋白質組學控制速凍食品的微生物安全仍是今后的熱點問題。

2.4 在速凍食品品質控制中的應用

速凍食品加工過程中，不同的加工條件會導致蛋白質發生變化，利用蛋白質組學技術挖掘表征原料品質的生物標志物，研究在加工過程中這些標志物的變化，成為速凍食品加工領域中的研究熱點。

速凍食品反復凍融會對產品的質構和風味產生較大的影響，為了解鮮肉和凍融肉蛋白質之間的差異，Kim 等[44]采用雙向凝膠電泳結合質譜對鮮肉和凍融肉的滲出物進行檢測，發現鮮肉和凍融肉的蛋白質表達有差異，發現有22 種蛋白質可用于區分鮮肉和凍融肉；熱休克蛋白是在動物中廣泛存在的一類高度保守蛋白家族，其中的Hsp27 和Hsp70 表達量與肉品質量密切相關，馬惠敏等[45]研究托盤、真空、高氧氣調和低氧氣調包裝等不同包裝方式對羊肉冷藏過程中Hsp27 和Hsp70 表達量的影響，并且測定冷藏過程中羊肉品質指標（pH 值、色澤、剪切力和蒸煮損失）的變化，發現Hsp27、Hsp70 與品質指標之間有顯著相關性，可作為羊肉加工過程中品質指標控制的生物標志物；He 等[46]研究羅非魚尸體貯藏過程中蛋白質組的變化，在貯存（冰藏0、7 d）后對羅非魚骨骼肌蛋白質組進行鑒定，共鑒定出902 個蛋白質，其中34 個蛋白質發生了顯著變化。選擇兩種差異豐富的蛋白質pgml 和ldha，用貯存0、7 d 的冰凍魚肉進行進一步驗證。發現冰藏羅非魚魚片的ldha 和pgm1 蛋白含量顯著低于新鮮羅非魚魚片，表明肉類嫩度與酶和厭氧條件引起的結構蛋白質降解和乳酸水平增加有關，為進一步研究新鮮和冰儲魚類之間魚肉質地和肉類嫩度差異的分子機制提供了重要基礎；Jia 等[47]采用蛋白質組學分析方法，對水煮、蒸和烘烤對山羊肉結構的影響進行研究，在對照樣、水煮樣、蒸煮樣和烘烤樣中分別鑒定出551、84、72、121 種蛋白質。感官評價和蛋白質組學分析結果表明，蒸煮處理對山羊肉的嫩度沒有顯著影響，而烘烤處理顯著降低了山羊肉的嫩度，表明目前保證山羊肉嫩度的有效熱處理方法是蒸煮處理。

近年來，一些食品加工新技術，如超高壓技術[48]、等離子體技術[49]、超聲處理技術[50]等在速凍食品加工中得到應用，利用蛋白質組學研究這些新技術在加工過程中的蛋白質變化，是研究者將密切關注的問題。

3 結論及展望

隨著蛋白質組學技術在速凍食品加工中的廣泛應用，蛋白質組技術將成為速凍食品加工研究的一個高通量、高靈敏度、高準確性的研究平臺，該技術將更加完善和成熟。今后，蛋白質組學在速凍食品原料選擇、品質評價、加工過程優化和安全控制領域將得到更廣泛的應用。但是，速凍食品加工是一個集原料學、工藝學和生物化學等多學科的跨學科產業，蛋白質組學要在速凍食品加工中得到更好的應用，需要多學科交叉融合、密切協作。此外，單靠蛋白質組學技術研究速凍食品加工發揮的性能有限，需要將蛋白質組學和基因組學、轉錄組學、代謝組學聯合、協同分析，在速凍食品生產領域發揮更好的作用。綜上，蛋白質組學技術將在速凍食品領域擁有廣闊的發展前景。