蛋白激酶D在人類冠狀病毒229E復制中的作用及機制研究

韓慧娟,劉 歡,趙志軍

人類冠狀病毒(human coronavirus,HCoV)可以引起輕微的普通感冒以及嚴重的呼吸系統疾病,是影響呼吸道健康的重要病因之一,也是我國兒童最常見的呼吸道疾病的主要病因[1-2]。目前已經發現3種高致病性人類冠狀病毒,分別是嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-associated coronavirus,SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle east respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)和嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)[3-4]。然而,在人群中傳播最廣泛的4種常見人類冠狀病毒分別是屬于α冠狀病毒的HCOV-229E(human coronavirus 229E)和HCOV-NL63(human coronavirus NL63)和屬于β冠狀病毒的HCOV-HKU1(human coronavirus HKU1)和HCOV-OC43(human coronavirus OC43),這些病毒通常引起人類自限性的輕度上呼吸道感染,約占普通感冒病例的1/3[5-7]。近年來研究發現,高爾基體在人類冠狀病毒復制周期中起到關鍵作用[8-9],主要作用是通過反式高爾基體網絡(trans-Golgi network,TGN)將含有包膜病毒顆粒的囊泡轉運到細胞膜表面,通過胞吐的方式釋放成熟病毒,然而,參與調控這一轉運過程的關鍵分子和機制尚不清楚。

蛋白激酶D (Protein kinase D,PKD)是由 PKD1、PKD2 和 PKD3組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,主要定位于細胞質、細胞核、高爾基復合體和質膜。在上皮細胞中,3種PKD亞型主要定位于反式高爾基體上[10]。細胞水平和動物模型的研究證明PKD參與多種疾病的發生與發展,包括癌癥、代謝紊亂、心臟病、中樞神經系統紊亂、炎癥性疾病和免疫失調等[11]。研究發現PKD抑制劑能夠顯著抑制多種癌癥細胞的生長和增殖,并對其他疾病的進展也顯示出較強的抑制作用[12]。盡管已有研究證實PKD參與細胞免疫應答,但在人類冠狀病毒感染過程中的PKD功能仍知之甚少。因此,本研究以參與調控TGN的關鍵分子PKD為切入點,側重分析PKD在人類冠狀病毒229E復制過程中的作用及其生物學意義。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒 MRC-5(醫學研究委員會細胞株5,貨號CCL-171)細胞和Vero-E6(非洲綠猴腎,貨號CRL-1586)細胞購買自ATCC公司。MRC-5細胞和Vero-E6在含10% 胎牛血清(HyClone,貨號SH30071.03IH30-45)的改良DMEM培養基(Sigma-Aldrich,貨號D0822)于37 ℃和5% CO2的培養箱中生長。

HCoV-229E由美國羅切斯特大學醫學中心免疫系Stephen Dewhurst博士提供。實驗用HCoV-229E在MRC-5細胞中擴增收集,并在MRC-5細胞上檢測病毒滴度以確定感染復數(multiplicity of infection,MOI)值。在HCoV感染實驗中,不同的時間和MOI值的HCoV-229E用來感染細胞,病毒在常溫孵育1 h后,放置在37 ℃下孵育進行細胞感染。

1.2 RNAi轉染 MRC-5細胞用靶向人蛋白PKD3(siPKD3,thermofisher,貨號AM51331)轉染24 h,使用Si-Control(thermofisher,貨號AM4611)作為非靶向對照。Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,貨號12566014)在Opti-MEM無血清培養基(Invitrogen,貨號31985062)中以3∶1 Si-RNA進行轉染。在細胞達到70%融合度時,細胞以MOI值為10的HCoV-229E預感染24 h,用Si-RNA轉染以敲低PKD3,收集細胞和病毒上清液用于測定。

1.3Prkd3過表達 在細胞達到70%融合度時,加入1 MOI的對照腺病毒(Ad-control)或Prkd3腺病毒(Ad-Prkd3)(signagen,貨號SL100971)轉染 MRC-5 細胞24 h,接下來進行下一步實驗處理。

1.4 PKD抑制劑處理和PI4KⅢβ抑制劑處理細胞 CRT0066101,購買自Tocris,純度為99.9%。PI4KIIIβ抑制劑(BQR695,貨號CAS 1513879-21-4)購買自MedKoo,純度為99.9%。為了測定抑制劑對病毒復制的影響,MRC-5細胞中加入的HCoV-229E MOI值為10;室溫下孵育1 h;然后用PBS洗滌以去除未結合的病毒; 用濃度梯度增高的劑量依賴性CRT0066101,BQR695或對照在37 ℃下處理細胞24 h。感染/復制結束時,收集細胞和上清液,并在4 ℃下以10 000 ×g離心5 min以除去細胞碎片,使用含有HCoV-229E的上清液進行TCID50滴度測定。細胞在感染/復制期結束時于RLT緩沖液中進行裂解收集總RNA,通過實時熒光PCR分析mRNA含量。

1.5 活細胞PIP2檢測 活細胞PI(4,5)P2檢測試劑盒(貨號D0400G)購自Montana Molecular,分離細胞并在完全培養基中重懸細胞,將 20 μL傳感器BacMam儲備液與 0.6 μL 500 mmol/L SB(丁酸鈉儲備溶液)和 24.4 μL完全培養基混合以制備轉導溶液。將細胞和轉導混合物混勻,在96孔板上于室溫下孵育30 min,后在培養箱中孵育24 h,然后通過自動熒光板讀數器測量熒光強度。

1.6 細胞活力測定 CCK8檢測試劑盒(貨號HY-K0301)購自MCE, 通過平行實驗于96孔板中進行活力測定,其中用CRT0066101處理未感染的MRC-5細胞和Vero-E6細胞。在處理結束前3 h,將10 μL CCK8溶液加入細胞中。將細胞于37 ℃下孵育4 h后,用酶標儀測量細胞活力。

1.7 病毒終點滴度測定(TCID50) 將MRC-5細胞或Vero-E6細胞在96孔板中用含2%FBS的DMEM培養基孵育,病毒連續稀釋8個稀釋度,重復6次,孵育3～5 d。根據Karber法計算每個孔中存在CPE的數量進行病毒滴度評估。

1.8 免疫熒光染色 細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min,使用0.25% 的Triton X-100處理15 min。PBS清洗3遍,加10%牛血清白蛋白孵育30 min。隨后,將細胞與指定的一抗mouse PI(4,5)P2(PI(4,5)P22C11) (Santa Cruz,貨號sc-53412), rabbit Anti-TGN46 antibody (Abcom,貨號Ab50595), HCoV-229E Human Coronavirus Spike RBD Antibody (R&D,貨號MAB10938), and mouse anti-P230 (fishersci,貨號BDB611280) 一起在冷藏室孵育過夜,然后與適當的Alexa Fluor偶聯二抗(thermofisher)孵育1.5 h。最后用4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,thermofisher,貨號D1306)對細胞進行染色以可視化DNA。在共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)下觀察細胞,并獲得圖像,使用ImageJ軟件分析圖像。

1.9 蛋白質印跡 收集HCoV-229E感染的細胞后,在含有蛋白酶(Sigma-Aldrich,貨號A32963)的冰細胞裂解緩沖液中裂解細胞,并將其用5X上樣緩沖液(thermofishe,貨號A32963)煮沸10 min。將蛋白質上樣到10% Bis-Tris SDS-PAGE凝膠上,然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下將膜封閉在5%牛血清白蛋白中1 h。將一抗(PKD1抗體, PKD2抗體, PKD3抗體和Tubulin抗體,均購自Cell signaling, 貨號2052,8188,5655和2144S)在4 ℃孵育過夜,二抗在室溫下孵育1.5 h,然后加入ECL試劑(Bio-Rad,貨號1705060S)并在imgaeDoc(Bio-Rad)上收集數據。

1.10 實時熒光定量PCR 從細胞中提取總RNA,PBS洗滌細胞,用含有β-巰基乙醇(Sigma,貨號19-1335)的RLT緩沖液(Qiagen,貨號74104)以1∶100稀釋度裂解。mRNA提取利用RNeasymini試劑盒(Qiagen,貨號74104)進行。使用Omniscript RT 試劑盒(Qiagen,貨號205113)在 37 ℃下逆轉錄 1 μg的 mRNA后進行 cDNA 的合成。CFX-96實時熒光定量PCR檢測系統(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)與iQ SYBR綠色超級混合物(Bio-Rad,貨號1725150)在94 ℃條件下進行聚合酶鏈反應(qPCR)10 min,40 次循環,94 ℃持續 15 s,58 ℃持續 30 s,72 ℃持續 30 s;并在 72 ℃下最終伸長15 min。使用引物對目標mRNA的水平進行定量,如下所示:HumanPrkd1上游引物5′- ACC CTT GGC TAC AGG ACT AT-3′, HumanPrkd1下游引物 5′- CCA CCT CAG GTC ATC ACT TTC-3′; HumanPrkd2上游引物5′- AGG GTT GGG TGG TTC ATT AC-3′, HumanPrkd2下游引物5′- TAT CTG TTG GTC GTG TTG TTC T-3′ ; HumanPrkd3上游引物5′- TGT TCC CTG CAA CTG TTT CTG-3′, HumanPrkd3下游引物5′- CTC TCT CGT GTG AGG CCA ATC-3′; Human Gapdh上游引物5′- GGT GAA GGT CGG TGT GAA CG-3′, Human Gapdh下游引物5′- CTC GCT CCT GGA AGA TGG TG-3′; HCoV- 229E 上游引物5′- TTC CGA CGT GCT CGA ACT TT-3′, HCoV- 229E 下游引物5′- CCA ACA CGG TTG TGA CAG TGA-3′, 18S rRNA 上游引物5′- CGC CGC TAG AGG TG A AAT TCT-3′, 18S rRNA 下游引物5′- CAT TCT TGG CAA ATG CTT TCG-3′。將每個基因的水平歸一化至18S rRNA或Gapdh的水平進行定量,并使用DNA擴增產生的標準曲線計算目的基因的確切拷貝數。

2 結 果

2.1 PKD家族成員在HCoV-229E感染過程中的表達 將MRC-5細胞以MOI值為10的HCoV-229E感染7 d,并在感染后的每天收集細胞樣品,通過qPCR分析檢測病毒的mRNA表達水平,結果顯示,HCoV-229E的病毒感染量在第4 d達到峰值(圖1 A)。同時, 與未感染組相比,Prkd1,Prkd2和Prkd3的表達水平均增加(圖1 B),Western blot結果顯示PKD1, PKD2和 PKD3的蛋白表達水平也顯著升高(圖1 C)。這些結果表明PKD家族成員參與HCoV-229E的復制過程。

注:A. qPCR檢測10MOI HCoV-229E感染MRC-5細胞過程中的mRNA水平;B和C. MOI值為10的HCoV-229E感染MRC-5細胞,共培養7 d,每天收集細胞并制備細胞提取物,qPCR檢測PKD家族的RNA水平(B), Western blot檢測PKD1, PKD2和 PKD3的蛋白表達水平(C),每組實驗均獨立重復3次。

2.2Prkd3敲除或過表達對HCoV-229E復制的影響 使用Si-RNA敲低Prkd3的表達,qPCR檢測結果表明Prkd3的表達水平下降了80%,而Prkd1和Prkd2的水平沒有顯著性改變(圖2 A)。Prkd3敲低的MRC-5細胞感染10 MOI HCoV-229E 48 h后,與對照組相比,HCoV-229E的mRNA表達量和滴度顯著降低(t表達量=8.999,P<0.001;t滴度=6.920,P<0.001)(圖2 B 和圖2 C)。在Prkd3過表達組,qPCR檢測結果顯示Prkd3表達增加了約4倍,而Prkd1和Prkd2水平沒有顯著性改變(圖2 D),且HCoV-229E的mRNA表達量和滴度水平顯著增加(t表達量=6.630,P<0.001;t滴度=5.794,P<0.001)(圖2 E 和圖2 F)。這些結果表明PKD3參與調節HCoV-229E在細胞內的復制。

注:A. MRC-5細胞進行Si-Prkd3或Si-Control的轉染處理,轉染后48 h提取RNA,qPCR定量Prkd1,Prkd2和Prkd3的mRNA水平;B和C. Si-Prkd3或Si-Control的轉染MRC-5細胞48 h,感染10 MOI HCoV-229E,qPCR(B)和TCID50實驗(C)測定測定病毒的mRNA和滴度;D. MRC-5細胞以1 MOI Ad-Prkd3或Ad-Control的轉染處理,轉染后48 h提取mRNA,qPCR定量Prkd1,Prkd2和Prkd3的mRNA水平;E和F. 1 MOI Ad-Prkd3或Ad-Control轉染48 h,MRC-5細胞感染10 MOI HCoV-229E,qPCR(E)和TCID50實驗(F)測定病毒的mRNA和滴度。每組實驗均獨立重復3次,結果以表示,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.3 PKD抑制劑CRT0066101在HCoV-229E復制過程中的作用 采用不同濃度(0,3,6,9,12,15 μmol/L)的CRT0066101處理MRC-5 細胞24 h,通過CCK8試劑盒檢測細胞活性,結果顯示,當CRT0066101濃度超過9.0 μmol/L時,出現了明顯的細胞毒性,而濃度在3.0 μmol/L以下對細胞活性沒有明顯影響(圖3 A)。以不同濃度(0,1,3,6 μmol/L)的CRT0066101處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5 細胞72 h,通過qPCR和TCID50檢測病毒mRNA表達量和滴度水平,結果顯示,與對照組相比,3.0 μmol/L CRT0066101處理的MRC-5 細胞,HCoV-229E復制水平顯著下降(t=6.931,P<0.001;t=4.055,P<0.01)(圖3 B 和圖3 C)。此外,免疫熒光染色結果顯示在HCoV-229E感染的MRC-5細胞中,HCoV-229E-RBD的表達水平顯著升高,TGN發生裂變,在CRT0066101處理組中,HCoV-229ERBD的表達水平顯著降低,TGN明顯聚合(圖3 D)。這些結果表明PKD抑制劑能夠有效減少HCoV-229E的復制和表達,且可能通過影響TGN裂變導致的。

注:A. 不同濃度梯度的CRT0066101處理MRC-5細胞,孵育24 h,并通過CCK8測定細胞活力;B和C. MRC-5細胞感染10 MOI HCoV-229E后,與不同濃度梯度的CRT0066101孵育72 h,qPCR(B)和TCID50實驗(C)測定病毒的mRNA和滴度,D. 對10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5細胞進行3.0 μmol/L CRT0066101處理,采用抗TGN46抗體和抗229E-RBD抗體進行免疫熒光染色,共聚焦顯微鏡下,比例尺為20 μm,每組實驗均獨立重復3次,結果以表示,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.4 PKD通過PI4KIIIβ調控TGN的裂變參與的HCoV-229E復制 為了進一步研究PKD是否通過調控TGN結構影響病毒復制,將10 MOI HCoV-229E感染MRC-5細胞1 h后加入3.0 μmol/L CRT0066101培養48 h,免疫熒光染色結果顯示,在病毒感染的對照組細胞中,TGN膜結構發生裂變,形成囊泡,然而在 CRT0066101處理后,TGN結構恢復正常,與空白對照組形態幾乎一致(圖4A)。已有研究表明,PKD通過磷酸化底物磷脂酰肌醇 4-激酶 IIIβ(PI4KIIIβ)將磷酸肌醇(PI)磷酸化為磷脂酰肌醇4-磷酸(PI4P),在磷脂酰肌醇5-激酶(PI4P5K)的磷酸化作用下生成磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[PI(4,5)P2],進而參與維持TGN的結構穩定[13]。為了明確這一信號通路是否參與PKD調控的HCoV-229E復制,采用siRNA敲低Prkd3的表達,檢測活細胞中PI(4,5)P2的生成,結果表明,與對照組相比,Prkd3的降低顯著抑制了PI(4,5)P2的表達水平(t=7.394,P<0.001)(圖4 B)。免疫熒光染色和活細胞PI(4,5)P2檢測結果顯示3.0 μmol/L CRT0066101處理的MRC-5細胞24 h的PI(4,5)P2的表達水平顯著降低(t=5.968,P<0.01)(圖4 C和圖4D)。采用1.0 μmol/L PI4KIIIβ抑制劑(BQR695)處理MRC-5細胞24 h后,與對照組相比,細胞中的PI(4,5)P2表達水平降低(圖4E),值得注意的是,1.0 μmol/L BQR695挽救了Prkd3過表達導致的PI(4,5)P2表達升高(t=6.671,P<0.01)(圖4 F),免疫熒光結果顯示1.0 μmol/L BQR695處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5 細胞24 h后,與對照組相比,TGN明顯聚合在一起(圖4 G),1.0 μmol/L的BQR695處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5細胞72 h后,免疫熒光染色表明BQR-695處理的MRC-5細胞中HCoV-229ERBD的表達水平顯著降低(圖4 H),不同濃度的BQR-695處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5 細胞72 h后,通過qPCR和TCID50檢測HCoV-229E的mRNA表達量和滴度水平,與對照組相比,0.1 μmol/L BQR-695處理的MRC-5 細胞中HCoV-229E的mRNA表達量和滴度水平顯著下降(t表達量=5.151,P<0.001;t滴度=7.744,P<0.001)(圖4 I 和J)。這些結果表明PKD通過調控PI4KIIIβ參與的PI(4,5)P2生成和TGN裂變,從而影響了HCoV-229E的復制。

注:A. 10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5細胞在3.0 μmol/L CRT0066101處理48 h,使用抗P230抗體和抗TGN46抗體進行免疫熒光染色,共聚焦顯微鏡下觀察TGN結構變化;B. 采用Si-Prkd3或Si-Control 轉染MRC-5細胞24 h,通過活細胞PI(4,5)P2法定量PI(4,5)P2水平;C和D. 10 MOI HCoV-229E感染MRC-5細胞后經3.0 μmol/L CRT0066101處理24 h,使用抗PI(4,5)P2抗體和抗TGN46抗體進行免疫熒光染色(C),共聚焦顯微鏡下觀察PI(4,5)P2和TGN結構變化,活細胞PI(4,5)P2測定法(D)定量PI(4,5)P2表達水平。E. 1.0 μmol/L BQR695處理HCoV-229E感染的MRC-5細胞24 h,通過活細胞PI(4,5)P2測定法測量PI(4,5)P2水平。F. 活細胞PI(4,5)P2測定法測量1.0 μmol/L BQR695處理Ad-Prkd3轉染的MRC-5細胞的PI(4,5)P2水平。G. 1.0 μmol/L BQR695處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5細胞72 h,使用P230抗體和抗TGN46抗體進行免疫染色,分析TGN結構。H. 1.0 μmol/L BQR-695處理10 MOI HCoV-229E感染的MRC-5細胞72 h,使用抗TGN46抗體和抗229E-RBD抗體進行免疫染色,并分析HCoV-229E含量。I和J:MRC-5細胞感染10 MOI HCoV-229E,并與不同濃度梯度的BQR-695孵育72 h。通過qPCR(I)和TCID50實驗(J)測定mRNA表達量和滴度水平。比例尺為20 μm,每組實驗均獨立重復3次,結果以表示,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.5 CRT0066101對HCoV-229E在Vero-E6細胞中的復制影響 基于CRT0066101在MRC-5細胞中對HCoV-229E復制和表達具有顯著抑制效果,進一步驗證CRT0066101在其他類型細胞中的作用。細胞活性檢測結果顯示,CRT0066101濃度低于3.0 μmol/L下對Vero-E6細胞沒有細胞毒性作用。在10 MOI HCoV-229E感染的Vero-E6細胞中使用不同濃度(0,1,3 μmol/L)的CRT0066101處理72 h后,qPCR和TCID50檢測病毒mRNA表達量和滴度水平。與對照組相比,3.0 μmol/L CRT0066101處理的Vero-E6細胞中的HCoV-229E的mRNA表達量(t=7.480,P<0.001)和滴度水平(t=7.228,P<0.01)顯著下降。這些結果表明CRT0066101在Vero-E6細胞中也能夠抑制HCoV-229E的復制。

3 討 論

蛋白激酶D在調節高爾基體膜裂變和融合,反式高爾基體網絡到質膜的囊泡轉運以及維持脂質穩態方面起著重要作用[14-15]。然而,PKD與人類冠狀病毒復制是否相關尚不完全清楚。本研究分析了PKD在HCoV-229E感染MRC-5細胞和Vero-E6細胞中的生物學作用,明確了PKD在HCoV-229E感染過程中顯著升高。與PKD1和PKD2相比,PKD3表達量的變化在HCoV-229E感染階段發揮重要作用。RNAi干擾敲低PKD3的表達和PKD抑制劑CRT0066101抑制PKD活性顯著降低HCoV-229E的mRNA表達和病毒滴度,表明PKD參與HCoV-229E的復制過程,機制上,PKD通過調控PI4KIIIβ影響TGN裂變參與HCoV-229E的復制。

本研究評估了PKD抑制劑CRT0066101在抑制HCoV-229E復制中的有效性。已有研究表明CRT0066101對多種病毒具有抗病毒活性,包括人類鼻病毒[16]、甲型流感病毒[17]、單純皰疹病毒1[14]和丙型肝炎病毒[18]。動物模型研究也表明,在80 mg/kg的劑量給藥情況下,CRT0066101具有良好的細胞耐受性[19]。本研究結果表明,3 μmol/L的CRT0066101在HCoV-229E感染的MRC-5細胞中的病毒抑制作用最顯著。值得注意的是,細胞活力測定的CRT0066101有效濃度遠低于細胞毒性劑量。這表明CRT0066101可以有效阻斷病毒mRNA復制和釋放,這是病毒復制周期中至關重要的晚期事件。本研究結果提示進一步使用動物模型評估CRT0066101的抗HCoV-229E復制作用值得研究。

本研究探索了PKD抑制劑阻斷冠狀病毒復制的潛在機制。研究表明,磷脂酰肌醇4-激酶 IIIβ(Phosphatidylinositol 4-kinase III beta,PI4KIIIβ)是高爾基體復合體結構的重要成分,也是PKD的底物之一[20]。PKD磷酸化PI4KIIIβ可以激活其脂質激酶活性并增強囊泡運輸[21]。PI4KIIIβ將磷酸肌醇(Phosphates Isositol,PI)轉化為磷脂酰肌醇4-磷酸(Phosphatidylinositol 4-phosphate,PI4P),后者在高爾基體膜定位中起到重要作用[13]。PI4P經過磷脂酰肌醇5-激酶(Phosphatidylinositol 5-kinase,PI4P5K)的磷酸化轉化為磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PI(4,5)P2)[22]。因此,測定PI(4,5)P2水平可間接反映PI4KIIIβ的激活情況。本研究發現,PI4KIIIβ抑制劑(BQR695)挽救PKD3過表達導致的PI(4,5)P2升高,表明PI4KIIIβ參與PKD調控的PI(4,5)P2的生成,這與先前觀察到的PKD調節PI4KIIIβ激活的結果一致[13]。Grazia Martina等[23]已經證實PI4KIIIβ的抑制劑抑制SARS-CoV-2的復制,這提示本研究的分子機制的合理性。

已有研究表明,PI4KIIIβ對于幾種小RNA病毒的RNA復制至關重要[24-25]。PI4KIIIβ是SARS-CoV刺突蛋白進入細胞的必需分子,它不會影響病毒在SARS-CoV S-ACE2結合或病毒內化階段,而是在病毒融合之前或融合時發揮作用,表明PI4KIIIβ調控SARS-CoV進入宿主細胞[26]。本研究結果表明,BQR695抑制PI4KIIIβ的活性能夠阻斷高爾基體裂變和囊泡運輸,且顯著降低HCoV-229E的mRNA復制和病毒滴度。這些數據表明,細胞膜和高爾基體之間的脂質循環對冠狀病毒的復制起到重要作用。最近的一項研究表明,宿主脂質激酶PI4KIIIβ的抑制劑可以在低至微摩爾濃度下阻斷SARS-CoV-2的復制[23]。但是,PI4KIIIβ能否抑制SARS-CoV-2的復制的機制仍需進一步研究。

綜上所述,本研究證實PKD作為一種新的宿主因子,通過調控PI4KIIIβ在冠狀病毒復制中發揮關鍵作用,并影響冠狀病毒感染細胞中的高爾基體的裂變和囊泡形成。本研究不僅加深了對PKD/PI4KIIIβ通路調控冠狀病毒復制機制的理解,也通過體外試驗證明了PKD抑制劑和PI4KIIIβ抑制劑顯著抑制人類冠狀病毒的作用,為研發廣譜抗病毒藥物以應對冠狀病毒感染提供了基礎。

(致謝:本研究項目在美國羅徹斯特大學醫學中心Zheng-gen Jin教授實驗室完成。)

利益沖突：無