多房棘球蚴原頭節感染后阻斷PD-1對巨噬細胞吞噬功能的影響

張 濤,張耀剛,楊紫晗,沈銀紅,馬艷艷

泡型包蟲病(Alveolar echinococcosis,AE)是由多房棘球蚴幼蟲感染引起的容易被忽視的人獸共患寄生蟲病。青藏高原地區是泡型包蟲病的高發區,青藏高原包蟲病平均檢出率是非青藏高原地區的10倍[1-2]。近年來研究發現,多房棘球蚴能在具有免疫能力的宿主體內長期存活并大量繁殖,從而使其實現免疫耐受[3-7],但其具體機制尚不明確。負性協同刺激分子程序性死亡分子1 (programmed death 1,PD-1)通過抑制或下調T細胞活化和IL10等細胞因子的產生增強機體對病原體的耐受,從而引起免疫抑制[8-9]。本研究通過多房棘球蚴原頭節(Protoscoleces,PSCs) 感染阻斷PD-1分析其對巨噬細胞吞噬功能的影響,明確PD-1在泡型包蟲病患者中免疫耐受的作用,為進一步揭示多房棘球蚴致宿主免疫耐受的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床組織樣本收集 根據術后AE患者肝臟組織的病灶定位,選取小于病灶周圍0.5 cm處肝臟組織為病灶近旁肝臟組織 (close liver tissue from the lesion,CLT);同時采集超過病灶2 cm以上的肝臟組織為病灶遠端肝臟組織(distant liver tissue from the lesion,DLT)。收集病灶近旁肝臟組織和病灶遠端肝臟組織置于10%的中性甲醛中固定過夜,用于病理切片。該研究通過青海大學附屬醫院倫理批準(P-SL-2019033),并在中國人類遺傳資源備案。所有AE患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞系 RAW264.7細胞購自中國科學院上海細胞庫,培養在含有10%FBS 的DMEM培養基中,置于37 ℃,5%的CO2培養箱中。

1.3 主要試劑及儀器 DMEM購自Gibco公司,胎牛血清購自上海達特希爾生物科技有限公司,信迪利單克隆抗體購自信達生物制藥有限公司,CD68抗體購自美國Novus biologicals公司,PD-1抗體和CD47抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。細胞成像微孔板檢測為美國伯騰公司產品,全景組織細胞定量分析系統為奧地利公司產品。

1.4 多房棘球蚴原頭節的分離與培養 將成功感染多房棘球蚴的長爪沙鼠異氟烷麻醉后,固定于解剖臺上,腹部毛發碘伏消毒后,取正中切口,充分暴露腹腔內的多房棘球蚴病灶,無菌剪刀和止血鉗鈍性分離病灶與腹腔之間的黏連,將病灶摘除放置無菌培養皿中,PBS反復沖洗直至無血液殘留。用無菌刀片將病灶剁碎后經80目和300目的篩網過濾后,加入含有20%FBS,5‰青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中制成多房棘球蚴原頭節混懸液。抽取10 μL的混懸液置于顯微鏡下進行觀察,存活的原頭節可活動,原頭節活力大于85%為制備成功。

1.5 細胞分組 巨噬細胞與PSCs按照1∶500的比例進行共培養,共培養時間分別為24 h、48 h和72 h。分組為:對照組、共培養24 h組、共培養48 h組、共培養72 h組。并給予1.5 mg/mL的信迪利單克隆抗體處理巨噬細胞后與PSCs共培養。

1.6 巨噬細胞吞噬實驗 將巨噬細胞與PSCs共培養在6孔板中,按照每1×105個巨噬細胞與2 000個PSCs共培養24 h、48 h和72 h后,每孔中加入1×106個帶EGFP標記的大腸桿菌(MOI=10∶1),37 ℃孵育1 h。棄掉培養基,PBS洗滌3次去除胞外的大腸桿菌。每孔中加入500 μL的DAPI,室溫孵育15 min,PBS洗滌5次后,每孔中加入500 μL的PBS,Biotek Cytation5拍照。使用Gen5 Image Prime 3.05軟件進行分析。

1.7 免疫組織化學染色法 肝臟切片依次經過二甲苯、無水乙醇、95%酒精、80%酒精、蒸餾水的脫蠟和水化,3%雙氧水去除內源性過氧化物酶,檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液抗原修復,5%BSA 孵育。配置CD68抗體(1∶200, Novus biologicals)稀釋液,滴加抗體稀釋液覆蓋切片組織,4 ℃過夜。滴加二抗稀釋液,室溫孵育1 h。依次滴加DAB顯色液和蘇木素染料,自來水沖洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.8 Western blot RIPA裂解液提取總蛋白,配置上樣體系 (樣本蛋白總量為10 mg,上樣體積為15 μL),沸水浴煮蛋白8 min。上樣體系加入至凝膠膠孔中,恒流60 mA,電泳約1.5 h,結束電泳。將“三明治”放入轉膜槽中,倒滿轉膜緩沖液,將轉膜槽置于冰中,恒流 180 mA轉膜 2.5 h。10%脫脂奶粉室溫封閉。PBST洗膜后,加入PD-1 (1∶1 000, Proteintech) 和CD47 (1∶1 000, Proteintech) 抗體稀釋液4 ℃孵育過夜。PBST洗膜后,二抗孵育;滴加適量的ECL工作液在膜上,拍照保存。

2 結 果

2.1 巨噬細胞在AE患者肝臟組織中的分布 通過免疫組織化學使用CD68標記巨噬細胞分析巨噬細胞在AE患者肝臟組織CLT和DLT中的分布,結果見圖1。AE患者術后肝臟組織中CLT中的巨噬細胞明顯高于DLT(t=188.0,P<0.001),提示巨噬細胞在AE患者病灶近旁肝臟組織帶大量聚集。

注:A.CD68標記AE患者手術切除肝臟組織的巨噬細胞;B.TissueGnosticsStrataQuest V7.1軟件識別病灶近旁肝臟組織、遠端病灶肝臟組織,并統計各部分中CD68陽性細胞數的分析結果; 兩獨立樣本比較采用t檢驗,雙側,***P<0.001。

2.2 多房棘球蚴原頭節感染抑制巨噬細胞的吞噬功能 通過巨噬細胞吞噬EGFP大腸桿菌來分析其吞噬作用,結果下圖2。PSCs感染巨噬細胞,發現共培養24 h(q=7.765,P<0.001)、48 h(q=13.61,P<0.001)和72 h(q=16.03,P<0.001)大腸桿菌的熒光強度降低,且隨著共培養時間增加大腸桿菌強度逐漸降低,以上結果提示PSCs感染巨噬細胞后導致其吞噬大腸桿菌的能力減弱。

2.3 多房棘球蚴原頭節感染促進CD47和PD-1的表達 采用Western blotting方法分析對照組、PSCs與巨噬細胞共培養組組不同時間點巨噬細胞CD47和PD-1蛋白的表達情況,結果見圖3。PSCs感染后巨噬細胞CD47和PD-1的表達增加,且隨著共培養時間增加其表達增加。

2.4 多房棘球蚴原頭節感染給予信迪利單抗處理后恢復巨噬細胞的吞噬功能 給予1.5 mg/mL信迪利單克隆抗體阻斷PD-1,評估PSCs巨噬細胞的吞噬功能的改變,結果見圖4。研究發現單獨給予信迪利單克隆抗體與對照組相比巨噬細胞中大腸桿菌的平均熒光強度無統計學差異(q=4.159,P=0.131),給予信迪利單克隆抗體處理后再給予PSCs共培養與單獨給予PSCs相比巨噬細胞中大腸桿菌的平均熒光強度強度增加(q=40.63,P<0.05),提示給予信迪利單克隆抗體可恢復巨噬細胞的吞噬功能。

注:A.阻斷PD-1后PSCs與巨噬細胞共培養后,巨噬細胞吞噬大腸桿菌;B.大腸桿菌的平均熒光強度;采用單因素方差分析,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

3 討 論

泡型包蟲病是一種被忽視的人獸共患疾病,也是一種全球性公共衛生問題。AE主要分布于北半球,尤其是中國、俄羅斯、北美,其中中國青藏高原地區泡型包蟲病的發病率占全球AE發病率的91%[10]。由于病灶組織在宿主體內呈浸潤性生長,沒有及時治療的患者10年病死率可達94%,故又稱之為“蟲癌”[11-12]。目前,AE的致病機制尚不清楚,本研究通過探索PD-1在多房棘球蚴感染對巨噬細胞吞噬作用的影響,從而為新的免疫治療提供依據。

當病原體感染后,巨噬細胞攝取病原體,病原體被困在吞噬體中,然后與溶酶體融合,在酶和過氧化物的作用下消滅病原體。既往研究發現細粒棘球蚴和其囊液能抑制巨噬細胞的吞噬作用。我們的研究發現巨噬細胞在泡型包蟲病患者病灶近旁肝臟組織大量聚集,但PSCs感染后抑制巨噬細胞的吞噬功能。巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用受多種“吃我”(促吞噬)和“別吃我”(抗吞噬)信號的調節。“別吃我”信號通路(包括CD47-SIRPα、CD24-Siglec-10、MHC-1(B2M)-LILRB1和PD-L1-PD-1) 通過與吞噬細胞上的受體相互作用來保護腫瘤細胞不被吞噬[13]。CD47作為一種免疫檢查點,通過與SIRPα結合可以將磷酸酶SHP-1招募至巨噬細胞的吞噬突觸,抑制肌球蛋白IIa的聚集,從而抑制巨噬細胞的吞噬作用[14]。PD-1/PD-L1免疫檢查點作為腫瘤細胞免疫逃避的機制之一,PD1通過與其配體PD-L1和PD-L2結合,抑制T細胞的活化和效應T細胞功能,從而抑制T細胞殺滅腫瘤細胞,最終導致腫瘤細胞的免疫逃逸[15]。血吸蟲感染的小鼠模型中發現,Toll樣受體2 (Toll-like receptor2,TLR2)通過誘導PD-L2高表達,PD-L2與PD-1結合后,可抑制T細胞免疫應答[8]。杜氏利什曼原蟲感染過程中阻斷PDL-1可防止T細胞耗盡,抑制自噬,并促進杜氏利什曼原蟲的清除[16]。我們的研究同樣發現PSCs感染后促進巨噬細胞PD-1和CD47的表達,信迪利單抗阻斷PD-1后可恢復PSCs感染的巨噬細胞的吞噬功能。因此,本研究發現PSCs感染后通過增加PD-1和CD47的表達,抑制巨噬細胞吞噬功能,引起免疫抑制,從而促進疾病進展。

綜上所述,PSCs感染通過促進巨噬細胞PD-1和CD47的表達,抑制巨噬細胞吞噬功能;阻斷PD-1后可恢復巨噬細胞的功能。然而有關PD-1在PSCs感染中免疫耐受中所發揮的作用還需通過體內實驗進一步加以驗證,從而為泡型包蟲病的治療提供依據。

利益沖突：無