四川黑茶渥堆發酵不同時期細菌群落結構與多樣性

嚴寬，李翔宇，張建，王玉潔，劉思岑，Manzar Abbas，李俊強

（宜賓學院 農林與食品工程學部，四川宜賓 644000）

黑茶是我國六大基本茶類之一，加工原料一般較為粗老．其初加工主要有4 道工序，其中渥堆是最重要的一步．渥堆進行的好壞直接決定了黑茶最終的品質，在這一過程中，由于微生物的參與，它們在其中進行代謝活動產生了很多特殊物質，這些物質造就了黑茶獨特的色、香、味[1]．因云南、湖南和四川等地的黑茶原料不同及生產標準的差異性，造成微生物群落在黑茶生產過程中所產生的特征風味也有所不同．周紅杰[2]發現：黑茶渥堆有許多的微生物的參與，以黑曲霉最多，酵母次之．研究者發現在六堡茶的茶堆中存在著大量的細菌、酵母、霉菌；而雅安藏茶的渥堆中的真菌種群主要是黑曲霉、塔賓曲霉、總狀枝毛霉、炭黑曲霉、根霉等；在茯磚茶渥堆過程中普遍存在的微生物主要是假單胞菌和克雷伯氏菌[3-5]．茶葉的品質受微生物的影響非常大，在發酵的不同的階段中將其中的微生物的配比調整為最適比例，將會極大地縮減發酵所需的時間．如果將黑茶的發酵過程的微生物種類、溫度和酸堿度加以控制和規范，可以使黑茶有穩定的品質[6]．另外，由于有害雜菌（如曲霉屬、青霉屬等[7]）對黑茶品質造成影響，在黑茶的生產過程中不但要注意有益菌的生長代謝活動，同時也要時刻關注有害菌的生長活動，及時排除其對茶品質的威脅．加強對黑茶發酵中的有益菌以及有害雜菌的研究，將對黑茶的生產、品質的把控以及風味的形成至關重要．

四川作為中國黑茶的主要產區，所生產的黑茶產品因其原料生長區域有著特殊的氣候條件，且在渥堆過程中的特殊環境條件和黑茶加工技術的差異，可能存在著與其它地區的黑茶完全不同的潛在微生物資源．目前對四川黑茶的研究主要針對其活性成分功能等的研究，鮮有對其渥堆發酵過程中有關微生物的報道．因此，本研究利用高通量測序研究黑茶渥堆過程的整個細菌群落結構多樣性研究黑茶堆制過程中細菌群落的結構和多樣性，分析其中細菌的種類和作用機制，為改進黑茶加工工藝和提高黑茶質量提供科學依據．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑茶樣品是由四川省茶業集團股份有限公司提供夏秋季采摘的茶樹鮮葉．在發酵過程中，將茶樹的葉子徹底混合以確保均質，并以適量的自來水噴灑以保持65%～75%（w/v）的固體含量和45～71°C的溫度．在發酵過程中重復三次并在以下時間間隔收集樣品：第0(YC)、8(W1)、16(W2)、24(W3)和32(W4)天．每天記錄每個發酵茶堆中心40 cm 深度的溫度情況．

1.2 DNA提取

將5 g 黑茶樣品在無菌條件下懸浮在50 mL Tween-NaCl 緩沖液[0.9% (w/v) NaCl、0.05% (v/v)Tween 20、2% (w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮]中，將勻漿在4 ℃的超聲儀中放置30 min．懸浮液過無菌紗布，4 ℃條件下，2000 r/min 離心2 min，去除顆粒物和上清液，在4 ℃ 12000 r/min 離心10 min，得到微生物沉淀．用E.Z.N.A.TM HP Plant DNA Kit（Omega Bio-Tek Inc., GA, USA）從沉淀物中提取微生物基因組DNA，用E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit進一步純化DNA制劑以去除可能的PCR抑制劑．

1.3 PCR擴增和克隆文庫的建立

利用引物338F 和806R（5'-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3' , 5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'）進行擴增，獲得細菌16S rRNA 基因的V3+V4 區域[8-9]．PCR 反應條件為：95 °C 3 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 45 s，30 個循環；72 °C 10 min；10 °C 10 min．PCR 反應體系為：加入5×PCR buffer (with Mg2+) 4 μL、2.5 mmol/L 的dNTP 2 μL、0.8 μL 的5 μmol/L P1 (338F)及0.8 μL 的5 μmol/L P2 (806R)，再加入0.4 μL 5 U/μL的Taq酶、2 μL DNA 模板和10 μL ddH2O．將PCR 產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再通過使用AxyPrep-DNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠來回收PCR 產物，并用Tris_HCl 洗脫；再用2%瓊脂糖電泳檢測，對PCR 產物進行文庫構建和評估，再利用Ilumina Miseq PE300 測序．根據PE reads 之間的overlap 關系，將reads 拼接(merge)成一條序列，同時對reads 的質量和拼接的效果進行檢測，根據序列首尾兩端的barcode 和引物序列區分樣品得到有效序列，對序列方向進行校正[10]．

1.4 數據處理

用Uparse OTU 聚類軟件工具在97%的身份閾值下進行系統進化聚類分析，以識別具有代表性的操作分類單元序列(OTUs)[11]．采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%識別閾值下的OTU 進行分類學分析．在界、門、綱、目、科、屬和種水平上創建每個樣本的群落組成和科學分類[12]．稀釋曲線是以個體數與物種數來構建曲線，需從樣本中隨機抽取一定數量的個體，統計這些個體所代表的物種數目，并利用Mothur 做稀釋曲線分析，利用R 語言工具制作曲線圖[13]．使用Chao 1、ACE、Shannon 和Simpson 指數計算每個樣品的α-多樣性，以評估測序深度和覆蓋率，并比較不同微生物群落的豐度和多樣性[14]．統計多個樣本中所共有和獨有的OTU數目，構建韋恩(Venn)圖[15]；根據分類學分析結果，對單個或多個樣本在各分類水平上進行比對，并使用R 語言工具構建群落結構圖[16-17]．

采用標準差(SD)的均值對所有數據進行解釋，并采用單因素方差分析(ANOVA)進行分析．在p＜0.05 顯著性水平下，采用Duncan 多重比較檢驗檢測所有樣本均數之間的變異．所有相關和路徑系數分析均使用和Excel 2019進行．

2 結果與分析

2.1 測序數據分析

表1 為5 個組的測序統計數據．YC-W4 五個時期的有效序列分別為62456 條、46909 條、40399條、43362 條、60400 條；檢測總堿基數分別為26118006 bp、19638346 bp、17285142 bp、18361869 bp、25535185 bp；序列平均長度分別為418.59 bp、420.24 bp、427.75 bp、423.51 bp和422.57 bp．

表1 5個組樣品的測序統計數據

稀釋曲線(Rarefaction curve)反映了樣品取樣的深度．從圖1 可知，這5 個組的曲線基本趨于平緩，說明取樣基本合理．四川黑茶內生細菌群落結構的置信度較高，能比較真實地反映黑茶樣本的內生細菌群落．

圖1 所有樣品的稀釋曲線

2.2 OTU聚類分析

對97%相似水平下的OTU 進行生物信息統計分析，并進一步繪制Venn圖（圖2），以直觀反映樣本在不同分類水平上的組成相似性和重疊情況．對有效數據進行聚類總共得到2 948 個OTU，分為42 個門、98 個綱、247 個目、461 個科、1 052 個屬和1 888個種．各個時期的樣本OTU 分別為2 082、2 116、381、399 和580 個．其中，YC 與W1 階段共有的OTU 為1 211 個，YC 與W2 階段共有的OTU 為15個，YC 與W3 階段共有的OTU 為25 個，YC 與W4階段共有的OTU 為50 個．各個時期的樣本獨有的OTU 分別為360、399、70、94、151 個，分別占各自總數的17.3%、18.9%、18.4%、23.6%和26.0%．而5 個時期樣品共有的OTU 數量為103 個，占所有樣本OTU 總數的3.6%，說明在進行渥堆發酵后，四川黑茶的細菌群落結構發生了顯著的變化．

圖2 OTU的Venn圖分析

圖3 屬水平下的細菌群落結構柱狀圖

2.3 Alpha多樣性分析

五個樣本測序深度均在0.9984 以上，能較好地代表不同渥堆發酵時期的黑茶樣本中細菌群落的真實情況(表2)；一般Shannon 指數越高，Simpson 指數越低，說明樣本中細菌群落多樣性指數越高[18]．YC和W4 兩個時期的樣品細菌群落多樣性高，W1 和W2 時期的次之，W2 時期樣品的細菌群落多樣性最低．Chao 指數和ACE 指數反映了樣本細菌群落的豐富度．YC時期樣品的細菌群落豐富度最高，其次為W4 和W1 時期樣品，W2 和W3 時期樣品的細菌群落豐富度最低，這說明不同渥堆發酵時期四川黑茶樣品的細菌豐富度和多樣性有較大差異．

表2 四川黑茶真菌群落豐富度和多樣性指數

2.4 不同時期黑茶渥堆細菌群落結構分析

在屬水平上注釋到明確分類地位的有18 個屬，其他相對豐度較低的合并為一類(others)，其中相對豐度較高的為假單胞菌、未分類腸桿菌(unclassified_f_Enterobacteriacea)、芽孢桿菌、考克氏菌屬（Kocuria）、青枯菌屬（Ralstonia）、乳酸桿菌、葡萄球菌、未分級葉綠體菌（norank_f_norank_o_Chloroplast）等．YC 時期，優勢菌為未分類腸桿菌(26.38%)，相對豐度較高的為考克氏菌屬(15.72%)，未分級葉綠體菌(8.32%)，鏈霉菌(5.92%)、假單胞菌(5.02%)、芽孢桿菌(4.73%)、葡萄球菌(4.19%)等．W1時期的優勢菌為未分類腸桿菌(26.38%),相對豐度較高的有未分級葉綠體菌(5.93%),假單胞菌(4.91%)、乳桿菌(3.18%)、雙歧桿菌(2.90%)、擬桿菌(2.10%)等．W2 時期中相對豐度最高的仍然是未分類腸桿菌(51.55%)，其次是假單胞菌(41.50%)，未分類細菌(unclassified_k_norank_d_Bacteria)(2.15%)，其他類細菌屬相對豐度均低于1%．W3 時期中假單胞菌(61.61%)為絕對優勢菌，相對豐度較高的有未分類腸桿菌(8.98%),考克氏菌屬(6.86%)，未分類細菌(6.97%)等．W4 時期中的芽孢桿菌(33.20%)相對豐度最高，其次是考克氏菌屬(18.63%)，乳桿菌(13.74%)、葡萄球菌(7.92%),青枯菌屬(7.39%)等．可以發現，假單胞菌屬和未分類腸桿菌在YC、W1、W2 和W4 時期中均有較高的豐度，而W4 時期主要以芽孢桿菌、考克氏菌屬和葡萄球菌相對豐度較高(圖4)，這說明四川黑茶中細菌屬的豐度隨不同渥堆發酵時期的不同而存在明顯差異．

圖4 屬水平下的群落結構熱圖

2.5 黑茶渥堆細菌群落組成對活性成分的影響

RDA 分析即冗余分析，是環境因子約束化的PCA 分析，將樣本和環境因子反映在同一個二維排序圖上，可以用來反映菌群與環境因子之間關系．從圖5 可以看出，在四川黑茶的4 個活性成分中，多糖（PO）與總黃酮(FL)呈正相關關系，而咖啡因(CA)與氨基酸(AA)均呈正相關關系．進一步對黑茶活性成分、細菌分類單元和不同渥堆時期之間的相關性分析表明，咖啡因、氨基酸的有效形成主要在YC、W1、W2 時期，且與未分級葉綠體菌和未分類腸桿菌有不同程度的正相關；多糖和總黃酮的含量增加主要在W4 時期，其中芽孢桿菌、青枯菌屬、糖多孢菌與總黃酮的形成相關性較高，而考克氏菌屬與多糖的形成密切相關；假單胞菌是W3 時期的優勢菌，但與以上四種黑茶的活性成分沒有相關關系，這表明渥堆細菌群落組成在一定程度上影響著四川黑茶活性成分的合成．

圖5 屬水平下的細菌RDA分析

3 討論

四川黑茶在渥堆過程中發生了一系列復雜的變化，其渥堆周期的長短和風味特征的形成主要取決于微生物群落結構的組成及變化．傳統的分離培養的方法，不僅耗時費力，而且有很多微生物無法培養出來．本實驗共得到高質量細菌序列253 526條，平均長度為422.53 bp．聚類后總共得到2 948 個OTU，分為42 個門、98 個綱、247 個目、461 個科、1 052 個屬、1 888 個種．這些數據表明渥堆中的活性細菌來自與渥堆相關的環境中，并且在整個發酵過程中將環境細菌接種到了茶堆中．因此本研究采用高通量測序技術探究了四川黑茶渥堆過程中細菌群落結構的組成及變化特征，有助于準確反映微生物種群數量．

近年來，對于黑茶中微生物群落組成的研究主要集中于以冠突散囊菌等為主的真菌，而對于黑茶中細菌群落組成的研究較少．Liu[19]等發現黑茶中細菌種類較為豐富．在發花早期，由于冠突散囊菌的生長，細菌的生長受到一定抑制，而在發花后期細菌總數量呈上升趨勢，與冠突散囊菌保持共生關系．Zhao[20]等發現不同地域黑茶細菌群落多樣性存在一定的差異．本實驗通過對四川黑茶渥堆中細菌群落多樣性的研究，獲得了大量的細菌資源．結果表明，在屬的水平上，由YC 到W3時期的樣品中檢測到了2 個相對豐度較高的屬，分別是未分類腸桿菌屬和假單胞菌，其中未分類腸桿菌屬在W2 時期樣品中的相對豐度最高，達51.55%．腸桿菌屬在自然界中分布廣泛（例如在土壤、水、植物、昆蟲和動物中），腸桿菌屬在黑茶渥堆發酵的前期占主導地位，且大多是無害的．黑茶中含有的假單胞菌、弧菌、葡萄球菌等通常被認為屬于條件致病菌[21]，其中假單胞菌對人體有一定的壞處，如通過感染傷口進入人體后，通過血液循環導致人類得菌血癥．在渥堆中產生或者某個時期生長比較旺盛的有害菌，他們在隨著渥堆的不斷進行導致茶堆的環境發生變化，抑制其的生長，能夠在一定程度上保證茶葉品質．假單胞菌在W3 時期樣品中的相對豐度最高，為61.61%．且在各個時期的黑茶樣品中均有較高豐度，為確定它們是否是病原體，其在黑茶中的作用和安全性還有待進一步研究．

本研究發現W4 時期的細菌群落多樣性程度較高，是四川黑茶品質形成的關鍵時期．W3 時期的樣品中芽孢桿菌是優勢菌，豐度達到33.20%．這可能是因為溫度逐漸降低，利于其生長．結果表明，在發酵的最后階段，溫度降低，細菌多樣性增加，細菌群落的組成可能與發酵溫度有關，這表明我們可以通過控制黑茶渥堆的溫度來控制微生物的分布．例如，通過在最后階段保持50℃，然后對茶磚進行快速干燥，可以將芽孢桿菌的豐度保持在高水平．有趣的是，芽孢桿菌屬中有許多是益生菌，對動物和人類的腸道環境，糞便頻率和特征以及皮膚特性均顯示出有益的作用[22]．其中凝結芽孢桿菌(Bacillus.coagulans)已作為一種食品成分進行了安全性評估，并被歐洲食品安全局添加到其合格安全性推定(QPS)清單中,并獲得批準美國食品藥品監督管理局公認的安全標準(GRAS)．由于凝結芽孢桿菌是黑茶發酵過程中的主要細菌，又是一種安全的益生菌，可以用以改善某些食品的風味和保質期．

本研究發現四川黑茶中部分活性成分如多糖、黃酮、咖啡因、氨基酸的含量和一些細菌屬豐度的相關性較高．在渥堆的YC、W1、W2 階段氨基酸和咖啡因的含量大大增加，未分類腸桿菌和未分級葉綠體菌是這一時期主要菌種，它們與氨基酸和咖啡因的形成有關，W3 階段假單胞菌是其中的優勢菌，在W4 階段多糖和總黃酮的含量增加，其中總黃酮與芽孢桿菌、青枯菌屬、糖多孢菌的形成相關性較高，而多糖與考克氏菌屬的形成密切相關．有研究表明，黑茶的活性成分的產生與細菌的代謝有著密不可分的關系，渥堆過程中多糖、總黃酮、氨基酸等活性成分存在一定程度的下降，這是由于微生物代謝的結果，普洱茶中也存在類似的現象[23]．微生物代謝所分泌的纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等對主要代謝產物具有催化作用[24]．在后續的研究中還需要進一步探究黑茶的活性成分以及微生物的多樣性，明確微生物在渥堆過程中的代謝機制，為日后對渥堆不同階段的調控提供依據，最終提升黑茶生產工藝和品質．

4 結語

四川黑茶因其獨特的香氣而在經濟上占有重要地位．微生物在其獨特的香氣、營養價值和品質的發展中起到至關重要的作用．對渥堆階段特定細菌組成的深入了解將為精確接種益生菌以進行生物強化提供標準．細菌16S rRNA 基因的高通量測序顯示，未分類腸桿菌的某些成員在YC、W1和W2早期渥堆階段占優勢；假單胞菌在W3 階段占優勢；最高的細菌多樣性在W4 階段．我們觀察到益生菌菌屬，如芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和糖多孢菌屬在W4 的最后渥堆階段大量存在．總之，在黑茶中有效接種這些細菌屬的成員可能會提高其營養價值．