NO對鋁脅迫下絳三葉種子萌發及幼苗生長的影響

周萬海，胡連清，劉雯雯，蔡意鳳，馮瑞章，魏琴，趙鑫，陳露

（1.宜賓學院 農林與食品工程學部，四川宜賓 644000；2.香料植物資源開發與利用四川省高校重點實驗室，四川宜賓 644000；3.自貢市農業科學研究院，四川自貢 643000）

豆科植物（Legμminosae）因富含油脂、蛋白質、 淀粉和維生素等營養物質，具有重要的社會和經濟意義[1]．近年來，由于酸雨和酸性肥料的使用，土壤酸化趨勢逐步增加，嚴重影響豆科作物的生長和產量．酸化土壤中，限制作物生長和產量的因素多種多樣[2]，除氮（N）、磷（P）等必需營養元素外，鋁（Al）影響最大，是限制作物生產的最關鍵因素之一，研究表明，酸化土壤中鋁常以不同形式存在，其中離子態[Al3+、Al(OH)2+]對植物毒害最重，鋁毒對植物的傷害首先表現于破壞根尖結構，抑制根系生長，進而影響植物的產量與品質[3]．一氧化氮（NO）是一種普遍存在于生物體中的信號分子，廣泛參與生物體內各種反應，在植物生長發育和抗逆反應中起關鍵作用[4]．一定濃度的NO 對植物側根、不定根和根毛的發育有促進作用[5]；鹽脅迫下外源添加亞硝基鐵氰化鈉（SNP）提高了苜蓿根系活力，促進了苜蓿幼苗根系生長[6]；外源添加SNP 能減輕鋁脅迫下西瓜根系氧化損傷，并通過影響根系對營養元素的吸收來緩解鋁毒作用[7-8]．因此，研究NO 對植物抗逆性的調控效應及作用機制不僅具有重要的理論意義和實踐價值，而且對保護農業生態系統和探究受損環境的生物修復途徑也具有重要意義．

豆科飼草絳三葉（T.incarnatum）為車軸草屬一年生優質牧草，因莖葉富含蛋白質且還可與根瘤菌共生固氮來促進自身生長和提高土壤肥力，目前已成為南方地區冬閑田的主栽牧草之一[9-10]，但受土壤酸化影響，鋁毒害已成為限制絳三葉生產的主要土壤環境因子之一，目前有關NO 對絳三葉耐鋁的緩解效應研究未有報道．為進一步闡明NO 在鋁中的作用，本文擬從豆科植物適應鋁脅迫的限度以及探究外源NO 對鋁脅迫下的豆科作物生理影響出發，探究絳三葉耐鋁毒害的能力以及外源NO 緩解鋁脅迫的機制，為進一步理解鋁脅迫對豆科植物生長抑制的作用機制及調控方法提供依據．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

絳三葉種子由河南世紀天緣生態科技有限公司提供，外源NO 供體為亞硝基鐵氰化鈉（SNP），鋁離子來源為分析純AlCl3．

1.2 試驗方法

①鋁脅迫對絳三葉種子萌發的影響．配置試驗處理液： CK（無菌水）、500、1 000、2 000、3 000、3 500、4 000、5 000、10 000 μM 的AlCl3溶液（均含有0.5 mM 的CaCl2溶液，pH4.0），選取飽滿均勻的絳三葉種子均勻置于墊有2 層濾紙的培養皿中，加入20 mL 處理液，每個處理組3 次重復，然后將培養皿置于25℃，12 h 光照/12 h 黑暗，濕度為60%的恒溫培養箱中發芽生長，處理4 d 后測定發芽勢，處理10 d后測定根長、芽長、生物量和發芽率．將該試驗結果得出的適宜鋁脅迫處理濃度記錄為FA．

②外源NO 對鋁脅迫下絳三葉種子萌發的影響．根據方法①的結果選取適宜的鋁脅迫處理濃度FA．試驗設置CK（無菌水）、FA、FA+100 μmol/L SNP、FA+150 μmol/L SNP、FA+200 μmol/L SNP、FA+300 μmol/L SNP 共6 個處理，選取均勻飽滿無損傷的種子，每皿放置50 粒，加入20 ml 處理液，每個處理3 次重復，之后每兩天加5 ml 處理液，10 d 后測定發芽率、側根數、主根長、芽長以及生物量．根據該結果選取添加外源SNP的適宜濃度記錄為FB．

③外源NO 對絳三葉幼苗生長及理化特性的影響．根據方法①②的結果采用沙培法，選取飽滿均勻的種子，消毒后播種于營養缽，發芽后，每3 d澆灌一次GS營養液，生長40 d后進行鋁脅迫處理．試驗設置如下處理：CK（Hoagland 營養液）、FB、FA、FA+FB 溶液4 個處理，每組處理重復3 次，培養條件為24 ℃/14 h，夜間20 ℃/10 h，相對濕度為60%～70%，處理10天后，剪取真葉，分裝于錫箔紙袋中，用液氮速凍后置于超低溫冰箱保存，用于后續理化指標測定．

1.3 測定指標與方法

（1）發芽率和發芽勢的測定．發芽勢：絳三葉種子萌發第4 d測定，以露出種皮的胚根長度達到種子自身長度為發芽的標準，以百分比表示，即發芽勢（%） = 4 d發芽的種子數/供試種子數×100%．

發芽率：絳三葉種子萌發10 d后測定，以突出種皮的胚根長度達到種子自身長度為發芽的標準，以百分比表示，即發芽率（%） = 10 d 發芽種子數/供試種子總數×100%．

（2）主根、芽、側根及生物量指標測定．每個試驗處理組隨機抽取10 株幼苗，用游標卡尺分別測量其主根長、胚芽長、側根數量，最后取平均值．從每個試驗處理組中隨機抽取20 株幼苗，在分析天平上稱重，取其平均值得到每株幼苗的鮮重；再在105 ℃下殺青15 min，恒溫烘箱中75 ℃條件下烘干1 h；最后稱重，取平均值得到每株幼苗干重．

（3）生理指標測定．葉綠素定量測定采用乙醇提取比色法；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250 方法[11]；膜脂過氧化產物丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法[11]；羥自由基含量測定采用Halliwell 的方法[12]；過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性測定參考Beers和Sizer的方法[13]；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參考Nakano and Asada 的方法[14]；愈創木酚過氧化物酶（GPX）活性測定參考Mrbanek的方法[15]．

1.4 試驗數據處理

用Excel 2010 軟件與Origin 2018 軟件處理數據和繪圖．

2 結果與分析

2.1 鋁脅迫對絳三葉種子萌發生長狀況影響

由表1 可知，隨鋁離子濃度的增加，絳三葉種子萌發逐步受到抑制，Al3+濃度升高到2000 μmol/L時，絳三葉種子的發芽勢與對照無差異，但發芽率比對照降低4.0%，根芽長、鮮重和干重分別降低2.942 cm、0.694 g和0.013 g，表明絳三葉受到鋁毒害，因此后期試驗選取其為鋁脅迫處理濃度FA．當Al3+濃度為3500～5000 μmol/L 時，絳三葉發芽速度明顯緩慢，發芽率顯著下降；5000 μmol/L 處理下，發芽率比對照降低40%．

表1 不同濃度酸鋁脅迫下絳三葉生長狀況的影響Tab.1 Effects of different concentrations of aluminum stress on the growth of T. incarnatum

2.2 外源NO對酸鋁脅迫下絳三葉種子萌發的影響

由表2可知，在2 000 μmol/L Al3+脅迫下絳三葉種子萌發的各項生長指標明顯受到抑制，其幼苗干重、鮮重、根系以及胚芽長與CK 相比明顯降低．而在2 000 μmol/L Al3+脅迫下添加外源NO后，絳三葉受鋁脅迫作用明顯緩解，外源添加100 μmol/L 與150 μmol/L SNP，絳三葉種子的發芽率與側根數量升高；從絳三葉幼苗根系及芽長來看，鋁脅迫明顯抑制絳三葉種子萌發后的根系與芽的生長，與對照（單一2 000 μmol/L Al3+脅迫）相比，添加100 μmol/L、150 μmol/L 和200 μmol/L 的SNP 提高了絳三葉種子萌發后的根芽的生長指標．從絳三葉幼苗干、鮮重分析，添加100 μmol/L SNP 提高了絳三葉幼苗的干重與鮮重．綜合來看，外源添加100 μmol/L SNP處理對鋁脅迫下絳三葉的促生效應最明顯，后期試驗采用此添加外源NO處理方式（FB）．

表2 SNP對鋁脅迫下絳三葉生長狀況的影響Tab.2 Effect of SNP on growth condition of T. incarnatum under aluminum stress

2.3 外源NO對鋁脅迫下絳三葉幼苗理化特性的影響

（1）外源NO 對絳三葉幼苗葉綠素及類胡蘿卜素含量影響．由圖1 可知，單獨用100 μmol/L SNP處理的實驗組，葉片的葉綠素a、b 和類胡蘿卜素含量無明顯變化．2 000 μmol/L-1Al3+處理下與CK 相比絳三葉幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b 與類胡蘿卜素的含量分別下降了15.8%、19.6%、18.8%．2 000 μmol/L Al3+處理下添加100 μmol/L SNP，與單一鋁脅迫處理相比，絳三葉幼苗葉片中葉綠素a 含量上升了13%；葉綠素b 的含量上升了6.5%；類胡蘿卜素含量上升了7.7%．結果表明，在鋁脅迫下，絳三葉幼苗葉片中的葉綠素與類胡蘿卜素含量降低．在添加SNP 后絳三葉幼苗葉片中的葉綠素和類胡蘿卜素含量有明顯升高，表明NO 對鋁脅迫造成的光合色素降解有一定的緩解效應．

圖1 SNP對絳三葉幼苗色素含量的影響Fig.1 Effect of SNP on pigment content of T. incarnatum seedling under aluminum stress

（2）外源NO 對絳三葉幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響．單獨用100 μmol/L SNP 處理的實驗組，葉片的可溶性蛋白含量與空白對照組CK 差異不大，2 000 μmol/L Al3+溶液處理使絳三葉幼苗葉片中可溶性蛋白含量上升了27.6%，在此條件下添加100 μmol/L 的SNP 溶液后，與單一用Al3+處理的絳三葉相比，葉片中可溶性蛋白含量下降了15.8% （圖2）．

圖2 SNP對絳三葉幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of SNP on soluble protein content of T. incarnatum seedling under aluminum stress

（3）外源NO 對絳三葉幼苗葉片羥自由基含量的影響．用100 μmol/L SNP 處理的葉片中羥自由基含量與CK 相比差別不明顯，在鋁脅迫下絳三葉幼苗葉片中羥自由基與CK 相比增加了103.5%，在添加100 μM SNP 后絳三葉幼苗葉片內羥自由基含量下降了31%（圖3）．這表明鋁脅迫會使絳三葉幼苗葉片中羥自由基大量累積，外源添加NO 能緩解鋁脅迫對絳三葉造成的毒害．

圖3 SNP對絳三葉葉片羥自由基含量的影響Fig.3 Effect of SNP on Hydroxyl radical content of Crimson T. incarnatum under aluminum stress

（4）外源NO 對絳三葉幼苗葉片抗氧化酶活性的影響．由圖4 可知，單獨用100μmol/L SNP 處理的實驗組與空白對照組CK 相比，葉片中CAT 活性降低不明顯，GPX 和APX 活性分別上升了6.9%和13.7%．與CK 相比在鋁脅迫下絳三葉幼苗中GPX活性上升了18.3%，CAT 和APX 活性分別下降了24.7%、51.4%；在添加SNP 溶液處理后，絳三葉幼苗葉片中，CAT、GPX、APX 分別升高了60.4%、60.5%、166.2%．結果表明，鋁脅迫能引起絳三葉氧化反應和酶系統活性改變，而外源NO 對鋁脅迫下絳三葉幼苗的抗氧化系統有一定的激活作用，能增加絳三葉抗氧化酶活性，緩解氧化脅迫對植物造成的傷害．

圖4 SNP對絳三葉幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of SNP on activities of APX、GPX and CAT in T. incarnatum leaf under aluminum stress

（5）外源NO 對絳三葉幼苗葉片膜脂過氧化產物（MDA）含量的影響．由圖5 可知，單獨用100 μmol/L SNP 處理的實驗組，葉片MDA 含量比CK降低16.2%．鋁脅迫下絳三葉植株葉片MDA 含量則比CK 增加17.8%．與單一鋁脅迫處理相比，添加100 μmol/L SNP，降三葉幼苗中膜脂過氧化產物含量下降了12.1%．這表明鋁脅迫會致使絳三葉片膜脂過氧化程度加深，而外源添加SNP 能緩解鋁對植物造成的毒害．

圖5 SNP對絳三葉葉片MDA含量的影響Fig.5 Effect of SNP on MDA content of T. incarnatum leaf under aluminum stress

3 討論

南方地區酸性土壤中富含大量的活性鋁離子[16]，抑制作物生長發育，影響作物品質及產量，對作物產生嚴重毒害作用．在實際生產中，鋁毒對作物生產最初的影響是種子萌發，梅文君等[17]發現在酸脅迫下，楚雄南苜蓿種子的發芽率、發芽勢等都隨著pH 值的降低而降低，在強酸性環境下，楚雄南苜蓿幼苗根長、莖長等顯著低于其他處理；許光德等[18]發現鋁脅迫明顯對向日葵產生毒害作用，促使細胞膜脂過氧化加重，抑制了種子的萌發以及幼苗的生長；張雅茹等[19]發現鋁脅迫使油菜幼苗的生長受到明顯的抑制，油菜的生物量降低．研究表明，添加適量的外源NO 可以有效提高植物種子的發芽率、發芽勢、幼苗根長和莖長[20]；適當濃度的外源NO 可以有效促進蘿卜種子萌發，減弱鋁脅迫下對蘿卜幼苗根長、莖長、葉長、葉寬產生的副作用[21]；張漢林等[22]發現外源NO 能夠促進鋁脅迫下黑麥草的生長和生物量的積累．本研究中，較低濃度的鋁脅迫，對絳三葉種子萌發及生長影響不大，表明其有一定程度的耐鋁能力，但高濃度鋁脅迫處理則明顯抑制了絳三葉種子萌發，且明顯降低了種子的發芽率和幼苗生物量積累，這與前人研究結果相一致[8,23-24]；在鋁脅迫下對降三葉外源添加100 mM SNP，其發芽率以及幼苗鮮、干重增加，說明NO 可以緩解鋁毒對絳三葉種子萌發和幼苗生長的抑制．

葉綠素參與植物光能的吸收、傳遞和轉化，類胡蘿卜素參與植物光能的吸收、傳遞，二者是反映植物光合能力的一個重要指標．光合作用為植物進行碳同化、有機物積累、為植物生長發育提供能量的過程[25]．鋁離子會破壞植物的光合系統，降低葉綠素和類胡蘿卜素的含量，抑制植物體的光合作用[26]．研究表明，鋁脅迫下西瓜葉片的葉綠素含量明顯降低，西瓜的生長與產量受到較大的影響[8]．適量的外源NO 可增加植物體內葉綠素的含量，從而增強植物的光合作用[27]．有研究表明，外源NO 處理可顯著增加黑麥草幼苗葉綠素a 的含量，提高葉綠素總含量[22]．本試驗中，高鋁脅迫下（2 000 μmol/L）絳三葉葉綠素與類胡蘿卜素含量明顯降低，光合色素的降低會直接影響植物的光合能力，從而影響植物的生長，降低作物的產量；添加一定外源NO 促進了絳三葉葉綠素與類胡蘿卜素的合成，從而提高其光合作用能力，促進其生長，增加有機物的積累．該結果說明外源NO 可以逆轉高鋁脅迫下絳三葉光合作用能力的降低，并緩解鋁對作物的毒害作用．

逆境脅迫下植物體內會產生大量的活性氧自由基并積累，破壞活性氧自由基與抗氧化酶之間的代謝平衡，若活性氧不能及時被清除，則會引起細胞膜系統受損，從而影響植物生理狀態和生長發育，植物膜脂過氧化過程中還會產生一些滲透調節物質，脅迫程度越高，其含量越高[23]．CAT、GPX、APX 等抗氧化酶能夠有效地清除活性氧[28]．NO 為調節植物生長發育的重要信號分子，其具有抗氧化作用，并能阻斷脂質過氧化反應、保護植株免受超氧化損傷以及增強植物細胞中抗氧化酶活性，從而緩解金屬離子對植物造成的毒害作用[29]．研究表明，NO 可通過提高滲透調節物質以及抗氧化能力來增強植物的抗逆性，同時顯著降低MDA 含量，緩解逆境造成的損傷[30]．在鋁脅迫下蘿卜幼苗葉片中的CAT 和APX 活性顯著下降，根尖的O-2產生速率和H2O2含量顯著上[21]．肖家昶[8]等發現鋁脅迫下西瓜根系可溶性糖與脯氨酸含量顯著上升，可溶性蛋白的含量無顯著差異，CAT 等抗氧化酶活性顯著降低，MDA含量增加，添加外源NO 增加了鋁脅迫下西瓜根系中脯氨酸含量顯著積累，促進西瓜根系抗氧化酶的合成，從而減少活性氧損傷，緩解鋁脅迫下生理損傷；鋁脅迫下外源添加NO 西瓜幼苗的CAT 等抗氧化酶活性及滲透調節物質含量提高，MDA 減少，從而減輕質膜過氧化的損傷[23]．本試驗中，鋁脅迫下絳三葉幼苗和可溶性蛋白含量升高，CAT、GPX、APX 活性明顯降低，膜脂過氧化產物MDA 明顯積累，該結果表明絳三葉受到嚴重鋁毒害；在添加100 mM SNP 后，絳三葉幼苗葉片中CAT、GPX 和APX抗氧化酶活性明顯提高，羥自由基含量和膜脂過氧化產物MDA 積累明顯降低，從而緩解鋁脅迫下絳三葉幼苗的生理損傷，該結果與前人研究一致[8,23,30]．但外源添加NO 后可溶性蛋白的含量降低，這可能是因降三葉幼苗是通過調節自身其他滲透調節物質抵抗逆境脅迫所致．

本研究表明，在2 000 μML 鋁脅迫下對絳三葉種子進行添加100 μM NO 處理，其光合色素含量提高，抗氧化酶活性提高，膜脂過氧化程度降低，其生長指標變好，絳三葉能更好地生長．結果表明，添加NO 提高了絳三葉對鋁脅迫的適應能力，緩解了鋁脅迫對絳三葉的毒害作用．該結果能為進一步理解鋁脅迫對豆科植物生長抑制的作用機制及調控方法提供參考依據．