植物蛋白源誘發魚類腸炎及修復的研究進展

王曉艷，李寶山，孫永智，王成強，黃炳山

（山東省海洋資源與環境研究院/山東省海水漁用飼料工程技術研究中心/水生動物營養與飼料研發創新示范平臺/山東省海洋生態修復重點實驗室/煙臺市海珍品質量安全控制與精深加工重點實驗室，山東 煙臺 264006）

隨著全球水產養殖業的迅猛發展，魚粉供不應求，植物蛋白源以產量穩定及價格低廉的優勢，在水產飼料中的應用逐年增加，然而豆粕、棉籽粕、菜粕等植物蛋白源中含有多種抗營養因子，且氨基酸不平衡、適口性差，對珍珠龍膽石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂)[1]、斜帶石斑 魚(Epinephelus coioides)[2]、花鱸(Lateolabrax maculatus)[3]等不同魚類研究均表明，飼料中大量使用植物蛋白源對魚類腸道形態及免疫功能具有負面影響，易引發食源性腸炎(Food induced enteritis,FIE)。FIE是魚類常見病，典型癥狀包括黏膜皺襞縮短、杯狀細胞數量增加、固有層和上皮下黏膜腫脹以及巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等炎性細胞的強烈浸潤，不同于細菌性和病毒性腸炎，FIE 不具有傳染性，為非傳染性亞急性腸炎[4]。FIE的發生不僅會導致魚類腸道損傷、嚴重影響營養物質消化吸收，還會降低飼料利用率、增加水體氮磷排放，嚴重影響水產養殖業的綠色可持續發展。

鑒于此，本研究梳理國內外近年來相關研究報道，總結魚類植食性腸炎發生的原因，并闡述益生元、益生菌及功能性氨基酸對食源性腸炎的修復作用，以期為功能性飼料添加劑在魚類FIE 修復方面的應用提供依據，為植物蛋白源在水產配合飼料中的高效利用提供參考。

1 植物蛋白源引起食源性腸炎的機理

植物蛋白源引起食源性腸炎一般歸因于其含有大量抗營養因子，如胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素、可溶性非淀粉多糖、植酸、皂甙、游離棉酚等[5]，植物蛋白源大量使用能夠增加魚類腸道通透性、造成組織和器官的病理學損傷、降低營養素消化吸收率及免疫力[6]。Hedrera 等分別使用豆粕、大豆分離蛋白和大豆皂甙誘導斑馬魚(Brachydanio rerio)腸炎，證實是大豆皂甙導致腸道炎癥而不是大豆蛋白[7]。胰蛋白酶抑制因子主要作用于腸道化學屏障：一方面能與小腸內的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶結合成穩定的復合物，降低酶活性及蛋白質消化率；另一方面能引起胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶過度分泌，導致含硫氨基酸代償性喪失[8]。植酸、單寧、可溶性非淀粉多糖等抗營養因子，主要通過影響化學屏障發揮抗營養作用。植酸在適宜的pH 條件下可與蛋白質形成難溶的植酸-蛋白質絡合物；單寧分子中有大量酚羥基團和芳香環結構，可與蛋白質形成絡合物；可溶性非淀粉多糖溶解后變成有黏性的溶液，包裹在營養素表面，形成凝膠，減少消化酶與營養素的接觸[9]；絡合物的形成及凝膠的束縛均會降低蛋白質利用率，并影響其他營養素的消化吸收。大豆凝集素主要通過機械屏障、化學屏障和生物屏障發揮抗營養作用：1）大豆凝集素與消化道表面結合，通過胞飲作用內化，引起上皮細胞微絨毛萎縮，增加隱窩深度而影響腸道結構；2）大豆凝集素會抑制小腸刷狀緣酶活性，并減弱消化酶的合成；3）大豆凝集素與腸上皮細胞的結合改變了腸道黏膜結構，從而改變了某些微生物在腸道表面的附著位點，并為細菌生長提供額外營養物質[10]。游離棉酚由于結構中含有活性醛基和活性羥基而有毒性，進入消化道后，會刺激消化道黏膜引起炎癥，還能與營養素形成絡合物直接排出，但其排泄比較慢，在體內有明顯蓄積作用[9]。

1.1 植物蛋白源對魚類腸道機械屏障的影響

腸道機械屏障是防御病原體入侵的重要防線，主要由上皮細胞和細胞間緊密連接組成。植物蛋白源對腸道黏膜的機械損傷在很多魚類上均得到證實：大豆濃縮蛋白和豌豆濃縮蛋白以1∶1 質量比混合替代魚粉25%以上，圓鰭魚(Cyclopterus lumpus)前腸黏膜褶皺高度變短，固有層寬度增加[11]；豆粕替代30%～60%魚粉，烏鱧(Channa argus)腸壁厚度不均勻，腸道褶皺短而稀疏[12]；豆粕替代量超過50%，花鱸腸道形態和黏膜屏障功能受到損傷[3]。腸道緊密連接的通透性決定整個腸道上皮細胞的屏障功能[13]，閉鎖蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudins)等跨膜蛋白和閉合小環蛋白(ZO)等外周胞漿蛋白，由外向內形成狹窄的帶狀結構，封閉細胞間隙，阻止腸腔有毒物質進入周圍組織，大菱鲆(Scophthalmus maximus)飼料中豆粕替代40%魚粉，腸道緊密連接蛋白Claudin-4、Occludin 和ZO-1 的表達量顯著下調[14]，腸道通透性增加，而機械屏障的完整性決定了炎癥發生時腸黏膜免疫反應的激烈程度。

1.2 植物蛋白源對魚類腸道化學屏障的影響

腸道化學屏障主要由黏液、消化酶、膽汁酸、溶菌酶等組成，能夠防止有害物質吸收。黏液層由腸黏膜上皮夾雜的杯狀細胞分泌，在腸黏膜表面形成一層膜狀保護結構，但多種腸道感染的疾病中均伴隨著杯狀細胞數目的異常增多，在圓鰭魚[11]和草魚(Ctenopharyngodon idellus)[15]上均觀察到植物蛋白替代魚粉引起的后腸杯狀細胞數量異常增加。據報道，飼料中高水平豆粕能夠降低膽汁酸合成及其相關基因(cyp7a1-2,cyp8b1-1和cyp8b1-2等)的表達量，并降低腸道溶菌酶活性[16]。植物蛋白原料中普遍存在的可溶性非淀粉多糖能與膽汁酸結合，減少膽汁酸與脂肪微粒的結合，此外，可溶性非淀粉多糖形成的黏性環境還能阻礙脂肪吸收微粒的形成，影響脂肪消化吸收[17]；胰蛋白酶抑制因子可與胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶迅速結合形成不可逆的復合物從而使這兩種酶失活[1]，對圓鰭魚的研究表明，飼料中大豆濃縮蛋白和豌豆濃縮蛋白以1∶1質量比混合物替代50%魚粉，中腸胰凝乳蛋白酶活性降低[11]。

1.3 植物蛋白源對魚類腸道生物屏障的影響

腸黏膜生物屏障主要由正常腸道菌群構成，腸道微生物能夠促進腸道上皮細胞增殖并強化魚體免疫機能[1]。當腸道黏膜受到外界刺激時，腸道菌群會第一時間作出響應，刺激免疫信號通路，調節相關受體蛋白以及非特異性因子的表達，清除病原體[18]。在大黃魚(Larimichthys crocea)[19]、珍珠龍膽石斑魚[1]等魚類上均報道了植物蛋白源替代魚粉引起了腸道菌群多樣性下降，腸炎致病菌如支原體科(Mycoplasmataceae)豐度上升，而腸道有益菌如從毛單胞菌科(Comamonadaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)等豐度下降，替代比例過高時，腸道菌群嚴重失調。

1.4 植物蛋白源對魚類腸道免疫屏障的影響

在組織病理學損傷的同時，通常會伴隨核轉錄因子-кB(NF-кB)和下游炎癥因子的激活[5]。炎癥反應初期，腸黏膜上皮細胞層的中性粒細胞出現大量浸潤和脫顆粒反應，巨噬細胞大量增加且浸潤，并從M0 或M2 型（圓形）轉化為M1（突觸狀）型，即由穩態轉化為促炎態，同時激活肥大細胞，自然殺傷細胞數目急劇增加[18]。對珍珠龍膽石斑魚的研究證實了飼料高水平豆粕可通過激活NF-κB、吞噬體、自然殺傷細胞介導的細胞毒性等信號通路介導腸炎的發生[6]。腸道黏膜免疫系統局部誘導細胞產生白介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)等促炎因子，效應細胞產生IL-4、IL-10、IL-13、轉化生長因子-β(TGF-β)等抗炎因子，一旦這兩部分細胞因子的功能和數量異常，腸道內穩態被打破，魚體極易受到病原體攻擊，病原可以在各組織中誘導更強烈的炎癥反應[20]，珍珠龍膽石斑魚豆粕型腸炎發生過程中，IL-6、TNF-α 等炎癥標志物表達均上調、抗炎細胞因子TGF-β和IL-10等表達顯著下調[6]。

2 功能性飼料添加劑對食源性腸炎的修復

2.1 益生元

益生元一般是指能選擇性促進腸道有益菌群增殖，對宿主健康及生長起到直接或間接促進作用的非消化性食物成分[21]，在維護魚類生長代謝、免疫、腸道健康等方面有較好效果。植物蛋白源已被證明會影響腸道菌群[3]，益生元可作為腸道中有益菌的營養底物，選擇性促進乳酸菌(Lactobacillus)、雙歧桿菌（Bifidobacterium）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）等有益菌增殖，使益生菌在數量和作用強度上占優勢[22]；另外，益生元可通過調節腸道菌群結構影響腸上皮細胞基因表達，修復受損的腸道黏膜[23]。常用的益生元主要是寡糖、多糖和酸化劑。

2.1.1 寡糖 目前水產養殖中應用最廣泛的是非消化性功能性低聚糖，又稱寡糖，主要包括甘露寡糖(MOS)[24-26]、殼寡糖[27]、果寡糖[28]、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、低聚異麥芽糖等（表1），含有不能被腸道消化酶打斷的化學鍵，在腸道內幾乎不能被消化吸收而直接進入腸道后段。MOS 是益生元中最具前景的一類，在鱸(Dicentrarchus labraxL.)[16-17,26]、金頭鯛(Sparus aurata)[25]上均驗證了MOS能提高腸黏膜褶皺高度和寬度、增加吸收表面積；MOS 對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)前腸絨毛形態沒有產生顯著影響，但在超微水平上觀察到了微絨毛長度和密度的增加[24]。寡糖對腸道黏膜的有益作用可能主要是通過調節腸道菌群實現[22]，0.4%果寡糖增加了羅非魚腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌(Lactobacillaceae)的數量，降低大腸埃希菌(Escherichia coli)和沙門氏菌(Salmonella enteritidis)數量[28]；3%木寡糖提高了庫圖擬鯉（Rutilus frisiikutum）幼魚腸道內異養需氧菌總活菌數[29]；2%半乳寡糖顯著提高了里海擬鯉（Rutilus rutilus）腸道原籍乳酸菌水平，腸道菌群朝有益方向發展[30]。

表1 寡糖對魚類腸道功能的影響Table 1 Effects of oligosaccharides on intestinal function of fish

2.1.2 多糖 多糖被認為是腸道功能調節劑，水產飼料中常用的主要有β-葡聚糖[32,33]、菊粉[34]、殼聚糖[35]和中草藥類多糖(如黃芪多糖[36]、茯苓多糖[37]、枸杞多糖[37])等（表2）。多糖對腸道調節主要體現在以下幾個方面：1）多糖能影響細菌對細胞的黏附，抑制腸道有害菌生長并促進有益菌生長，改善動物腸道微生態環境[34]；2）多糖能不同程度阻斷和抑制病毒對細胞的作用，降低病毒引起的細胞凋亡，并抑制病毒復制、阻滯病毒吸附[38]，如黃芪多糖可以修復病毒感染導致的黏膜損傷，維持輔助型T 細胞1/輔助型T細胞2(Thl/Th2)細胞動態平衡，上調小腸黏膜組織T-box 基因家族新型轉錄因子(T-bet)和GATA 基因家族轉錄因子(GATA-3)蛋白表達并促進分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的分泌[39]；3）多糖具有清除自由基、減緩脂質過氧化的作用，對珍珠龍膽石斑魚的研究證實了這一觀點[32]；4）多糖能夠調節炎癥反應，對大菱鲆的研究發現，酵母β-葡聚糖和羧甲基葡聚糖能通過降低炎癥因子表達量，調節炎癥反應[33]。但是，也有研究發現，某些多糖過量使用可能會造成魚類腸道損傷，大口黑鱸(Micropterus salmoides)低魚粉（26%）飼料中添加高劑量（12%）菊粉，腸道好氧菌和革蘭陰性菌相對豐度顯著下降，引發肝、腸組織損傷，而在高魚粉（52%）組該損傷并不明顯[40]。因此，益生元使用時應根據魚種、規格及植物蛋白添加量確定適宜添加量，以免過量添加對魚體產生不利影響。

2.1.3 酸化劑 腸道堿度升高會破壞腸黏膜屏障的完整性，有機酸及其鹽類能通過H+沉積降低消化道pH[43]。目前魚類飼料中常用有機酸主要有乙酸、丙酸、丁酸、乳酸和檸檬酸等短鏈有機酸[43]（表3），其中，乳酸有利于增加腸道吸收面積并促進腸道免疫防御系統；乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸(SCFAs)在維護腸道屏障、氧化應激、炎癥及免疫系統穩態等方面發揮重要作用，SCFAs 作為G 蛋白偶聯受體(GPCRs)的配體，可通過調節炎癥小體和單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信號通路增強腸上皮細胞間的緊密連接[44]；這些有機酸尤其是丁酸可作為腸細胞的主要能源基質，并有利于免疫細胞的育成和腸上皮細胞的增殖[45]；另外，α-酮戊二酸也是腸道的主要能源物質，80%的α-酮戊二酸氧化反應在腸道中進行，氧化產生的大量三磷酸腺苷(ATP)為腸細胞供能[46]，松浦鏡鯉(Cyprinus carpio)飼料中添加α-酮戊二酸顯著提高了腸道消化能力及腸道組織結構[47]。

2.2 益生菌

益生菌通常是指能夠促進其他生物健康的細菌或微生物。魚類飼料常用的益生菌主要有乳酸菌、芽孢桿菌(Bacillus)、乳桿菌(Lactobacillus)、酵母菌(Saccharomycessp.)、乳球菌(Lactococcus)、丁 酸梭菌(Clostridium butyricum)等(表4)。益生菌作用于腸道的主要機制被認為有以下幾點：1）益生菌與腸道黏膜上皮細胞相應的糖受體結合，占據黏附位點并形成保護性生物膜，競爭性抑制大腸埃希菌、沙門氏菌等有害菌的黏附與定植[52]，阻斷病原菌的附著-繁殖-致病途徑[53]；2）益生菌在腸道內的代謝產物，如乳酸、短鏈脂肪酸等，會降低腸道pH從而抑制病原菌生長、促進營養物質消化吸收[23]；3）腸道內益生菌通過調節炎癥過程來維持腸黏膜的完整性[54]。在眼斑雙鋸魚(Amphiprion ocellaris)[55]、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[56]、大口黑鱸[57]等魚上均證實了益生菌對魚類腸道菌群穩態、黏膜屏障及炎癥反應的有利作用。然而尼羅羅非魚停用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）后，出現了腸道菌群失調、腸上皮細胞受損的現象，可能是因為該菌在其腸道的黏附性差，停用后短時間內被排出體外，為致病菌提供了黏附位點[58]。因此水產飼料中使用益生菌需充分考慮益生菌在腸道內能否定植及定植時間。

表4 益生菌對魚類腸道功能的影響Table 4 Effects of probiotics on intestinal function of fish

含有益生菌和益生元混合物的產品被稱為合生元。研究發現，與單獨攝入益生菌或益生元相比，合生元可能會以更有效方式作用于機體[23]。0.01%枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和0.01%低聚木糖配伍，團頭魴（Megalobrama amblycephala）生長性能、消化酶活性、抗氧化性能均優于單獨添加[61]；100 μg/g 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)與100 μg/g 低聚木糖配伍，異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)腸道微生物益生菌數量明顯多于單獨添加[62]；但也有研究發現，芽孢桿菌聯合菊粉在調節金頭鯛促炎因子表達上的效果并不優于芽孢桿菌單一使用組[63]。這提示在益生菌和益生元配伍時，應注意益生元的選擇。

后生元是指對宿主健康有益的無生命微生物和/或其成分的制劑，主要包括菌體代謝產物和菌體組成成分，菌體代謝產物包括肽、細菌素、胞外多糖、短鏈脂肪酸、無細胞上清液、維生素、有機酸、部分生物表面活性劑等，菌體成分包括肽聚糖、脂磷壁酸、磷壁酸、細胞壁多糖、細胞表面相關蛋白等[64]。對小鼠的很多研究均證明，后生元在調節腸道炎癥反應及菌群結構等方面具有積極作用：植物乳桿菌MTCC5690、發酵乳桿菌LMTCC5689 和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）NCFM 等乳酸桿菌菌株的S 層蛋白可有效改善小鼠結腸炎癥狀[65]；熱滅活的戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）S-PT84 能夠維持小鼠腸道屏障的完整性[66]。近年來，后生元在水產上也逐漸引起人們的重視，對斑馬魚模型的研究發現，0.025%酵母葡聚糖和1%鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)GG 胞外多糖能有效改善斑馬魚腸道菌群結構[67]；長雙歧桿菌(Bifidobacterium longumReuter)胞外多糖能顯著提高鎘脅迫下金魚(Carassius auratus)的蛋白酶活性；有益菌在腸道內發酵生成的乳酸、SCFAs、CO2和氫等有機酸或代謝產物能降低腸道pH，抑制對pH 敏感的大腸埃希菌和沙門氏菌等病原菌繁殖[23]，在尼羅羅非魚[21]、西伯利亞鱘(Acipenser baeriBrandt)和非洲鲇(Clarias gariepinus)[68]等魚上的研究均報道了飼料中補充益生元后魚腸道中乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽等SCFAs含量的升高及腸道功能的改善。植物乳桿菌CICC6257 的脂磷壁酸能有效抑制鰻弧菌(Vibrio anguillarum)對銀鯧(Pampus argenteus)腸道上皮細胞的FIECs 的黏附，通過抑制NF-κB 的活化和NFκB 抑制蛋白的降解，降低IL-8和TNF-α的表達，從而減輕腸道炎癥反應[69]。后生元對魚類腸道的益生功能已經在多種魚類上得到證實，但其所涉及的作用機制及信號通路有待深入研究。

2.3 功能性氨基酸

功能性氨基酸是指除了合成機體蛋白質外還具有其他特殊功能的氨基酸，飼料中添加晶體氨基酸能改善植物蛋白替代魚粉后魚類的生長和健康狀況[70]，如精氨酸[71]、谷氨酰胺[71-74]、蘇氨酸[75-76]、色氨酸[77-78]、賴氨酸[79]等氨基酸都能促進腸道發育，有利于腸黏膜損傷后的修復（表5）。NF-кB 的觸發會刺激炎癥因子的表達，而精氨酸能通過激活AMP活化蛋白激酶a1(AMPKa1)信號分子，抑制NF-кB p65信號分子，從而保護腸黏膜屏障功能[74]，對大菱鲆[71,74]、建鯉(Cyprinus carpiovar.Jian)[73,80]、珍珠龍膽石斑魚[72]等魚的研究發現，精氨酸可通過增強腸道黏膜屏障功能減輕食源性腸病，而精氨酸缺乏導致建鯉腸道緊密連接蛋白表達異常[80]；對草魚的研究發現，蘇氨酸可能通過Keap1a/Nrf2 信號，調控腸道抗氧化酶及其亞型基因表達，增加相應酶的活性和非酶類抗氧化物質還原型谷胱甘肽(GSH)的含量，從而維持草魚腸道細胞結構的完整性[75]；賴氨酸能通過肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和蛋白激酶C(PKC)信號分子調節魚類腸道緊密連接蛋白基因表達，通過螯合Cu2+阻截由銅應激引起的酶性抗氧化系統損傷[79]，賴氨酸缺乏會降低幼建鯉對病原菌的識別、黏附和溶菌能力而導致腸道菌群失衡[81]；牛磺酸是含硫非蛋白氨基酸，其調節腸道的可能機理被認為與賴氨酸類似，通過MLCK 調節腸細胞間緊密連接蛋白基因表達[82]。

3 小結和展望

益生元、益生菌、功能性氨基酸等添加劑本身具有綠色、無毒、無污染、不產生抗性等特點，在飼料禁止使用抗生素及魚粉供不應求背景下，配合飼料中大量添加植物蛋白的同時，應適時添加功能性添加劑，以改善魚類腸道環境，增強機體免疫，減少食源性腸炎的發生。

使用過程中應注意以下問題：

1）使用益生元應該根據不同養殖品種、規格確定適宜添加量，以免過量使用帶來副作用；

2）針對特定物種，篩選在腸道中定植時間久的菌種，并在生產中根據其定植周期定期投入，防止停止添加后腸道菌量快速減少甚至失效，以便維持其益生優勢；

3）兩種或多種類型添加劑聯合使用時，應根據各添加劑的穩定性、安全性及協同/拮抗作用來確定種類和比例。

目前，益生元、益生菌、功能性氨基酸等添加劑對魚類食源性腸炎修復作用的評價多聚焦于對實驗動物生長性能、腸道消化酶活性、腸道菌群、炎癥因子和抗炎因子基因表達等層面的影響，對益生菌的定植缺乏理論認知，對添加劑的作用機理研究不夠深入，今后應該針對不同益生菌的定植機制及有效添加劑的作用機理作深入解析，為開發更有效的水產飼料添加劑提供理論基礎，以促進水產養殖業的健康可持續發展。