復配添加劑對模擬運輸斑點叉尾鮰幼魚生化指標和組織結構的影響

李豪華，廖 濤，白 嬋，邱 亮，鉏曉艷，李海藍，陳麗萍，熊光權，王炬光

（1.農業農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室/湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064；2.蘭州理工大學，生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050；3.湖北省農業科技創新中心農產品加工研究分中心，湖北 武漢 430064；4.武漢市東西湖區農業技術推廣中心，湖北 武漢 430044）

斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）隸屬鲇形目鮰科，是世界知名的淡水養殖魚類，也是我國主要的淡水經濟魚品種之一[1]。斑點叉尾鮰幼魚在運輸過程中應激反應明顯，常導致其免疫力下降、造成皮膚黏液流失等損傷；且長途運輸過程中需要經常換水來避免水質惡化，這會造成水資源和時間成本浪費[2]。

牛磺酸不僅促進魚類生長，還參與滲透調節、膜穩定性和抗氧化防御系統等[3]。維生素C（VC）能夠影響不飽和脂肪酸的過氧化，促進膽固醇代謝，并降低皮質醇的含量[4]。維生素E（VE）有著較高的生物活性，具有調節魚類新陳代謝的能力[5]。谷氨酰胺被可為生物體（包括魚類）提供碳源和氮源[6,7]。谷氨酸鈉溶于水后解離成的鈉離子和谷氨酸，不僅可以為魚類調節滲透壓，而且谷氨酸能與血漿中的氨結合生成谷酰胺，緩解氨中毒[8]。上述五種水溶性化合物常被添加到養殖飼料中來改善魚類的健康[9-13]，但目前將其作為運輸水中添加劑用于提高魚類運輸抗應激能力的研究報道較少。本研究通過向運輸水體添加不同體積分數的復配水溶性添加劑，通過測定模擬運輸水質，幼魚應激、抗氧化能力和組織形態（皮膚、鰓）等指標，探討復配水溶性添加劑對斑點叉尾鮰幼魚運輸應激的影響，驗證添加劑使用是否能夠減少換水時間、提高魚類抗運輸應激能力，以期在實際運輸中縮短時間成本，為提高斑點叉尾鮰幼魚運輸質量提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

斑點叉尾鮰幼魚體質量（16.22 ± 0.82）g，體長（13.40±0.35）cm，購于嘉魚縣三湖漁業有限責任公司。實驗開始前，幼魚被放置在直徑1.5 m、高1.3 m的圓柱形塑料循環缸組成的循環水養殖系統中進行為期2 周的適應，養殖水為經過2 d 曝氣的自來水，養殖密度為8.33 g/L，溫度為（23.0±0.5）℃，氨氮質量濃度＜0.02 mg/L，溶解氧質量濃度＞6 mg/L，pH為7.12 ± 0.21，保持12 h/12 h 的明暗周期并每天監測幼魚健康狀況，以2%幼魚體質量的用量飼喂斑點叉尾鮰專用商品飼料（購自通威股份有限公司），每日2 次（9:00 和16:00）。正式實驗開始前禁飼24 h，以清空幼魚消化道。

1.2 復配添加劑配制

根據文獻[14-18]及預實驗結果，確定復配水溶性添加劑溶液由70 mg/L 牛磺酸、40 mg/L VC、18 mg/L VE納米乳液、20 mg/L 谷氨酰胺和0.6 mg/L 谷氨酸鈉混合制成。其中，由于VE是脂溶性維生素，需先參考馬愈迪等[19]方法制備納米乳液，具體配制方法為VE（1.17 g）、吐溫80（0.7 g）、無水乙醇（3.3 g）、水（7.8 g），以800 r/min 的轉速攪拌30 min，即得到復合維生素E納米乳液。

1.3 實驗設計

設置6 個實驗組，按照復配水溶性添加劑的不同體積分數（20%、40%、60%、80%、100%）分別為復配添加劑組，即F-20%組、F-40%組、F-60%組、F-80%組、F-100%組。以不進行任何添加劑處理的為對照組（Control）。將復配添加劑組和對照組進行模擬運輸。參考企業運輸魚水質量比m魚∶m水=1∶4密度進行模擬近、中、遠3 個業內典型時長（5、9、14 h）運輸；每個實驗組設置3 個平行，共12 組。實驗采用塑料盒（21 cm×13.9 cm×8.5 cm）開放式充氧的運輸方式，每個盒子中注入曝氣水1 L，使用空氣泵持續供氧以模擬裝箱開放式運輸，模擬運輸溫度為20 ℃。暫養結束后，取規格相同的3 尾魚根據比m魚∶m水=1∶4的密度放置在含有不同濃度的復配添加劑運輸水體中作為靜息組（BT)。實驗結束后，將各運輸組幼魚分別置于不同水族箱中，監測其72 h死亡率。

1.4 樣品采集與測定

1.4.1 水質指標 在模擬運輸前靜息狀態時（BT）和不同模擬運輸時間段（0、5、9、14 h）分別取200 mL水樣，使用HQ40哈希HACH 多參數數字化分析儀（上海哈希水質分析儀器有限公司）測定溶解氧（DO）和溫度（℃），PHS-25 pH計（鞏義市子華儀器有限責任公司）測定pH，按照HJ 535—2009《水質氨氮的測定納氏試劑分光光度法》進行總氨氮濃度的測定。

1.4.2 生化指標 在每個采樣時間點用漁網捕撈3 尾斑點叉尾鮰幼魚，用1 mL 一次性無菌注射器采用尾部靜脈取血的方式收集血液。然后將血液在冷凍離心機中以3 000 r/min 在4 ℃條件下離心10 min，將上清液（血清）移入1.5 mL 離心管中并保存于-80 ℃冰箱直至分析。血清中皮質醇和葡萄糖含量測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

每個處理組取3 尾魚，收集（1.1±0.5）g 肝臟組織放入15 mL 離心管中，按照m組織∶m生理鹽水=1∶9 的比例（質量分數0.9%的生理鹽水）在冰上使用勻漿機進行勻質，后在4 ℃、10 000 r/min 條件下離心10 min，收集上清液，保存于-80 ℃待分析。肝臟中過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）濃度、總抗氧化能力（T-AOC）均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

1.4.3 組織切片 取新鮮的鰓、皮膚，大小在1 cm2以內，固定在質量分數4%的多聚甲醛中備用。用體積分數70%～100%的乙醇溶液以體積分數10%的增加量進行梯度脫水處理。使用二甲苯進行透明處理，石蠟包埋，切片機進行連續切片，厚度約5 μm，通過蘇木精-伊紅染色后脫水，最終封片，置于顯微鏡下觀察并記錄。

1.5 統計分析

通過SPSS 19.0 軟件對實驗數據進行統計學處理分析，結果以平均值± 標準差表示。采用誤差正態性（偏度-峰度檢驗法）和方差齊性檢驗（Levene's test）后，對復配添加劑濃度和運輸時長進行雙因素方差分析（Two-way ANOVA），對于交互作用顯著的因素進行簡單效應分析（One-way ANOVA），并采用鄧肯（Duncan's）事后檢驗進行差異顯著性比較。各組之間的顯著性水平α=0.05。使用GraphPad Prism 9.0軟件繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 復配添加劑對幼魚模擬運輸存活率的影響

所有參與實驗的斑點叉尾鮰幼魚在模擬運輸14 h和實驗結束72 h后無死亡記錄。

2.2 復配添加劑對幼魚模擬運輸水質的影響

實驗組水質參數如表1 所示，不同實驗組的總氨氮水平經過14 h 的模擬運輸后顯著上升（P＜0.05），在模擬運輸5 h、9 h 時，F-60%組和F-100%組的總氨氮水平顯著高于對照組（P＜0.05）。在整個模擬運輸過程中，F-40%組的復配添加劑組總氨氮水平顯著低于對照組（P＜0.05）。隨著模擬運輸時間的增長，不同實驗組的pH 值顯著下降（P＜0.05），但經過模擬運輸14 h 后，各復配添加劑組的pH值都高于對照組，其中F-40%組pH值最高。

表1 不同濃度的復配添加劑下斑點叉尾鮰幼魚模擬運輸過程中水質變化Table 1 Changes in water quality during simulated transport of juvenile Ictalurus punctatus under different concentrations of compound additive

2.3 復配添加劑對幼魚模擬運輸應激指標的影響

復配添加劑實驗血清皮質醇（COR）變化如圖1(A)所示，在整個模擬運輸過程中，各實驗組的血清COR 含量與運輸前相比顯著上升（P＜0.05），復配添加劑組血清COR 含量低于對照組。在模擬運輸結束后，F-40%組的復配添加劑組COR 質量濃度最低（112.71 ng/mL），較運輸前上升34.25%。圖1(B)表示不同實驗組血清葡萄糖（GLU）含量變化情況，運輸5 h，對照組組、F-20 組、F-60 組和F-100 組GLU含量均顯著上升，F-40組較其他各運輸組GLU含量顯著降低（P＜0.05），在模擬運輸9 h 時各實驗組GLU 含量達到最低。經過14 h 的模擬運輸，對照組、F-20 組、F-60 組和F-100 組較運輸9 h 時GLU 含量顯著上升（P＜0.05），F-40%組和F-80%復配組血清GLU含量顯著低于其他實驗組（P＜0.05）。

2.4 復配添加劑對幼魚模擬運輸抗氧化指標的影響

不同復配添加劑組模擬運輸過程中CAT 活性如圖2(A)所示，隨著模擬運輸時間的增加，對照組肝臟中CAT 活性顯著上升（P＜0.05），并始終高于不同復配添加劑組。模擬運輸5 h，F-20%組復配組肝臟CAT 活性顯著低于其他實驗組（P＜0.05）。模擬運輸結束14 h，F-40%組復配組肝臟CAT 活性最低。由圖2(B)可知復配在模擬運輸5 h，對照組MDA含量顯著高于不同復配添加劑（P＜0.05），而各復配添加劑組MDA含量無顯著差別。在整個模擬運輸過程中，與靜息BT組相比，各運輸組MDA含量顯著上升（P＜0.05）。經過14 h 的模擬運輸，F-40%組MDA含量最低。如圖2(C)所示，與靜息BT組相比，各運輸組經過14 h模擬運輸其肝臟組織中T-AOC水平顯著上升（P＜0.05）。在模擬運輸14 h 時，F-40%組的T-AOC水平顯著低于其他實驗組（P＜0.05）。

圖2 復配添加劑對斑點叉尾鮰幼魚模擬運輸抗氧化指標的影響Fig.2 Effects of compound additive on antioxidant indices of juvenile Ictalurus punctatus during simulated transport

2.5 復配添加劑對斑點叉尾鮰幼魚鰓、皮膚組織結構的影響

組織學結果顯示，靜息BT 組幼魚的鰓、皮膚結構正常，而運輸組幼魚的鰓、皮膚出現不同程度的損傷。如圖3 所示，F-20%組鰓小片排列方向左右不一致，且發生了彎曲現象。F-40%組鰓小片結構完整，但鰓絲內出現了細胞增生現象。F-80%組鰓小片中血細胞出現了不同程度的空泡化現象，鰓絲內黏液細胞腫脹。F-100%組鰓絲內出現了嚴重的細胞增生現象，黏液細胞出現了一定程度腫脹。各復配添加劑組鰓組織雖然出現了破損現象，但損傷程度都低于對照組。

圖3 不同復配添加劑組經過14 h模擬運輸斑點叉尾鮰幼魚鰓的形態Fig 3 Gills morphological changes of juvenile Ictalurus punctatus of different treatment groups after 14 h simulated transport

如圖4所示，靜息BT組幼魚的皮膚結構完整，經過14 h模擬運輸后，對照組表皮糜爛、上皮細胞嚴重脫落，黏液細胞大量分泌，上表皮層變薄。F-20%、F-60%和F-100%組的表皮都出現了脫落變薄現象。F-80%組皮膚結構完整，但出現了一定程度的黏液細胞肥大現象。F-40%組皮膚結構完整，黏液細胞數量增多。

圖4 不同復配添加劑組經過14 h模擬運輸斑點叉尾鮰幼魚皮膚的形態Fig.4 Morphological changes of skin of juvenile Ictalurus punctatus of different treatment groups after 14 h simulated transport

3 討論

3.1 復配添加劑對幼魚模擬運輸水質的影響

溶解氧、溫度、pH值、總氨氮等參數是評估水質的最常用、最有效標準[[20]。魚類運輸過程中一般均處在一個較為封閉的環境，水質易朝壞的方向發展，最終水質惡化導致魚體發生應激[21]。魚類氧呼吸作用產生的二氧化碳會溶解到水中，導致運輸水體酸化并降低pH值[22]。本研究結果顯示，運輸導致各實驗組的總氨氮水平隨著時間的延長而升高。F-20%組、F-40%組和F-80%組水體中總氨氮水平在整個運輸期間顯著低于對照組（P＜0.05），而F-100%組水體中總氨氮水平高于對照組，表明一定濃度的復配添加劑可以降低幼魚的新陳代謝，從而減少氨類物質的排泄，過高濃度的復配添加劑可能會影響水質，導致幼魚代謝速率加快，釋放大量氨類物質到水中，最終導致水中氨氮含量增加。然而，pH 值則呈現出相反的趨勢，這可能是因為一定濃度的復配添加劑能夠降低幼魚的應激水平，使代謝水平升高速率減緩，相對減少二氧化碳在水中的積累。Biswal 等[23]也發現使用質量分數0.2%葡萄糖使南亞野鯪（Labeo rohita）幼魚在運輸過程中的氨排泄減少，同時運輸水質的pH 值降低減緩。本研究也發現，通過向水中加入添加劑可以減少魚體在運輸過程中氨氮、二氧化碳等代謝廢物的排泄，能夠達到在減少或取消中途換水操作的同時，還能將水質維持在較好水平的目標。目前常規魚苗實際運輸中一般需要進行數次換水，每換水一次耗時0.5～1.0 h，而通過本研究復配水添加后對斑點叉尾鮰幼魚進行14 h 長距離運輸時，可免除換水操作，縮短運輸時長1～2 h。

3.2 復配添加劑對幼魚模擬運輸應激指標的影響

魚類應激程度指數可以通過皮質醇的增加和持續時間來表示[24]，皮質醇含量是常用來評估運輸初級應激的一個重要生理指標[25]。在本研究中，經過14 h 模擬運輸，各實驗組的皮質醇含量顯著上升，這與大蓋巨脂鯉（Colossoma macropomum）的研究結果相似[26]。本研究結果表明，與對照組相比，通過使用復配添加劑可以減少運輸過程中幼魚血清皮質醇的產生，提高抗應激能力。血清葡萄糖常用來評估魚類次級應激參數[27]，血清葡萄糖的變化主要由神經和內分泌系統調節，是魚類代謝活動的重要功能物質[28]。本研究結果表明，在模擬運輸初始階段（0～5 h），對照組血清葡萄糖含量顯著上升，而復配添加劑組血清葡萄糖含量低于對照組，這說明運輸應激導致幼魚代謝水平紊亂，復配添加劑減小了幼魚的運輸應激，緩解了體內能量代謝的失衡。在模擬運輸中后期（5～9 h），長時間運輸應激導致幼魚消耗大量能量，致使對照組血清葡萄糖含量降低。但添加劑的使用提高了幼魚的抗應激能力，在整個模擬運輸過程中其血清葡萄糖變化趨勢低于對照組，這與WANG 等[29]對團頭魴（Megalobrama amblycephala）的研究結果類似。

3.3 復配添加劑對幼魚模擬運輸抗氧化指標的影響

運輸已被證明可誘發魚類的氧化應激，使機體內迅速產生大量氧化自由基（ROS）破壞細胞的正常生理活動[30]。CAT是生物抗氧化防御系統中的一種關鍵酶，通過清除ROS，產生無毒的分子氧和水[31]。機體內ROS 會與生物膜發生脂質過氧化反應（LPO），而LPO 的最終產物MDA 是魚類體內抗氧化能力的重要指標[32]。T-AOC 是生物體整體抗氧化能力，可以較為全面地衡量生物體的抗氧化能力[33]。本研究中，斑點叉尾鮰幼魚的CAT 活性和MDA 含量隨著運輸時間的延長而顯著增加，可能是水中總氨氮水平升高、pH值下降以及長時間的運輸應激，導致幼魚產生過多的ROS，通過激活體內抗氧化系統，誘導負反饋機制調節額外CAT 的分泌和提高LPO 生成更多的MDA，來清除體內產生的過多ROS 以維持體內氧化還原平衡。牛磺酸、VC、VE和谷氨酰胺均有抗氧化作用，能夠清除機體內過量的ROS，從而緩解氧化應激[15,34-36]。谷氨酸鈉雖然是魚類非必需氨基酸，但其分解產生的谷氨酸可以促進谷胱甘肽的合成。谷胱甘肽具有清除ROS的能力，因此谷氨酸鈉可以間接提高魚類的抗氧化能力[37]。在整個運輸過程中，復配添加劑組的CAT 活性和MDA 含量低于對照組，表明復配添加劑添加能夠提高幼魚的抗氧化能力。對照組T-AOC 經過14 h 的模擬運輸顯著升高，表明通過向運輸水中加入適當濃度的復配添加劑，可以緩解幼魚的運輸應激，減少過量活性氧的生成，進而降低魚體T-AOC 水平。應激條件改變能量消耗和氧需求，從而影響氧化狀態，本研究結果表明，通過向水中加入含?；撬?、VC、VE納米乳液和谷氨酰胺和谷氨酸鈉的復配添加劑可以提高斑點叉尾鮰幼魚的抗氧化應激能力，而F-40%組的CAT 活性、T-AOC最低，說明該濃度添加劑對幼魚抗氧化應激?；钚Ч罴?，此條件下幼魚體內生成的ROS 較少或能夠被及時清除，進而受到的氧化損傷較小。

3.4 復配添加劑對斑點叉尾鮰幼魚鰓、皮膚組織結構的影響

魚類的鰓組織參與許多重要的生理活動，如有氧呼吸、滲透調節、氮廢物排泄和pH 調節等[38]。水產養殖生產中魚類會受到某些環境因子引起的脅迫，會產生活性氧和含氮物，誘導鰓組織發生生理和形態改變[39]。在本研究中，經過14 h運輸，各實驗組幼魚的鰓組織發生了不同程度的損傷，且對照組損傷最為嚴重。這可能是因為復配添加劑具有抗氧化能力，減少了氧化自由基的產生，提高了幼魚在運輸過程中的抗應激能力。

魚類皮膚在自身免疫方面具有重要的作用，皮膚表面分泌的黏液是抵御外來病原體入侵的第一道防線[40]。本研究結果顯示，運輸應激會導致幼魚皮膚結構發生一定的破壞，對照組皮膚表面變薄，可能是由于碰撞、顛簸等不利環境引起的運輸應激所導致的。復配添加劑組的皮膚結構較為完整，損傷程度低于對照組，表明復配添加劑可以有效緩解運輸應激。

4 結論

本實驗發現，各添加劑組在運輸過程中肝臟抗氧化指標（CAT 活性、MDA 含量）低于對照組，皮膚和鰓組織結構較為完整，說明向運輸水中加入復配添加劑能夠維持幼魚在運輸過程中體內氧化還原反應的動態平衡，緩解了無氧代謝水平以及減少氧自由基的產生，減輕運輸脅迫對斑點叉尾鮰幼魚的損傷。其中F-40%組可有效緩解運輸脅迫導致的水體總氨氮、血清COR、GLU 含量的升高及水體pH值的降低。

綜上，復配添加劑能夠提高斑點叉尾鮰幼魚有水運輸過程中的抗應激能力，減少甚至免除換水操作，縮短運輸時間且維持幼魚的健康狀態，這為魚類長途運輸提供新思路。