不同體質量黃鰭金槍魚能量代謝相關酶活性與基因表達

李 倩，李 鈺，符文雅，肖 娟，黃 海，郭志強,4

（1.海南大學生命健康學院，南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 海口 570228；2.海南大學食品科學與工程學院，海南 海口 570228；3.熱帶海洋生物資源利用與保護教育部重點實驗室，海南省熱帶海洋漁業資源保護與利用重點實驗室，海南熱帶海洋學院水產與生命學院，海南 三亞 572022；4.海南大學海洋科學與工程學院，海南 海口 570228）

金槍魚（Thunnus）肉質鮮美，富含蛋白質、脂質、不飽和脂肪酸等多種營養物質，備受消費者喜愛，具有很高的市場需求[1]。黃鰭金槍魚（Thunnus albacares）是金槍魚的一種，具有游泳速度快、高代謝能力特點[2]。研究表明，在常規游泳速度條件下，黃鰭金槍魚的氧代謝率為776 mg/（kg·h），約為其他硬骨魚的6～8 倍[3]。此外，黃鰭金槍魚可以通過增強心血管系統，增大鰓表面積來實現高代謝率[4]。有研究發現，糖原作為肌肉能量產生的關鍵底物，同時也是潛在的能量儲存庫，能夠維持多種魚類能量平衡[5-6]。魚體內代謝受相關酶活性的影響，且代謝酶活性與基因表達調控有關[7-8]。因此，組織代謝能力高低可通過測定組織糖原含量、能量產生途徑中關鍵代謝酶活性和相關基因的表達來評估。

魚類的生長發育過程中，其體質量與魚體代謝密切相關。Schultz 等[9]發現，高溫條件下大西洋銀漢魚（Menidia menidia）小魚相比大魚消耗更多能量。Churova等[10]研究發現，大西洋鮭（Salmo salar）肌肉組織碳水化合物代謝相關酶活性與體質量呈正相關。此外，Vornanen 等[11]研究發現，小型黑鯽（Carassius carassius）的糖原儲存含量明顯高于大型黑鯽。黃鰭金槍魚在其生長發育過程中，體質量變化很大，最大可達225 kg，從小魚到大魚不同階段對能量的需求不同。同時，黃鰭金槍魚為維持持續的游泳需要消耗大量能量，其運動和能量代謝與骨骼肌密切相關[12]。骨骼肌是維持全身代謝和運動的重要組織，根據功能主要分為兩種類型：白色肌肉（下文簡稱“白肌”）和紅色肌肉（下文簡稱“紅肌”）[13]。白肌主要依賴于糖酵解支持的無氧代謝供能進行爆發性運動，紅肌主要依賴于有氧代謝供能進行持續肌肉收縮運動[14]，已經在多種魚類的研究中被證實。Shibata 等[15]研究發現，太平洋藍鰭金槍魚（Thunnus orientalis）通過增加白肌中無氧代謝基因的表達和紅肌中有氧代謝基因的表達來產生大量能量。Gao 等[16]對紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）紅肌和白肌組織研究發現，紅肌比白肌具更好的氧化酶水平。另外，Wu 等[17]也在羅非魚（Oreochromis niloticus）的肌肉組織中發現，白肌主要參與爆發性的肌肉收縮運動，紅肌主要參與持續的肌肉收縮運動。

目前，國內金槍魚人工養殖技術仍處于初步探索階段，僅見南海水產研究所開展相關研究[18]，且關于黃鰭金槍魚紅肌和白肌的能量代謝研究較少，也尚未見不同體質量黃鰭金槍魚能量代謝差異的研究。基于此，本研究選取不同體質量的黃鰭金槍魚紅肌和白肌組織作為研究對象，通過對不同肌肉組織中糖原含量、能量代謝相關酶活性和基因表達量進行測定，探討不同體質量下黃鰭金槍魚肌肉組織能量代謝差異，了解不同生長階段黃鰭金槍魚的能量需求，為優化金槍魚養殖方案，推動人工金槍魚養殖產業發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黃鰭金槍魚樣品于2022年5月以海釣的方式捕獲于南海中部海域（17°41'N～18°17'N，110°60'E～112°14'E），共收獲9 尾黃鰭金槍魚樣品。黃鰭金槍魚樣品捕獲上船后，用1 g/L的MS-222（上海麥克林生化科技有限公司）進行麻醉處理30 s，立即解剖樣品，采取紅肌和白肌組織（白肌取自腹部肌肉，紅肌取魚體腹部側線附近肌肉)。然后立即放入1.5 mL無菌離心管中并用液氮冷凍，后轉移至-80 ℃冰箱保存待用。根據各樣本體質量大小和性腺發育特征[19]，將樣品分為小魚（0.85±0.03）kg、中魚（9.77±0.15）kg 和大魚（19.63 ± 0.37）kg 三個體質量組，樣品基本信息如表1所示。

表1 不同體質量組黃鰭金槍魚統計表Table 1 Statistical table of Thunnus albacares of different body mass groups

1.2 肌肉組織酶活性測定

稱量各體質量組紅肌和白肌組織樣本，按照質量∶體積=1 g∶9 mL 的比例，加入提取液進行機械破碎以制備勻漿，在4 ℃、10 000 r/min 條件下離心10 min，取上清勻漿液。采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白（TP）濃度，采用動力學方法用檸檬酸合成酶（CS）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、磷酸果糖激酶（PFK）、乳酸脫氫酶（LDH）、蘋果酸脫氫酶（MDH）和糖原試劑盒（南京建成生物工程研究所和北京索萊寶科技有限公司）測定不同體質量組紅肌和白肌組織相關酶的活性以及糖原含量。其中CS、MDH、SDH、LDH 酶活性和蛋白濃度測定溫度條件為37 ℃；HK、PK 和PFK酶活性測定溫度條件為25 ℃；糖原含量在沸水浴條件下進行測定。

1.3 基因表達分析

用Trizol 試劑根據試劑盒說明提取肌肉組織的總RNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳、Nano Drop 2000C超微量分光光度計檢測RNA 濃度和純度。用諾唯贊生物試劑反轉錄合成cDNA，放置于-40 ℃用于測定基因表達量。依據NCBI 數據庫中黃鰭金槍魚基因組數據［Thunnus albacares-NCBI-NLM（nih.gov）］用Primer Premier5軟件設計相關基因引物，并由擎科生物公司合成具體的基因引物序列如表2所示。最后以β-actin作為內參基因，使用SYBR qPCR試劑盒進行實時熒光定量PCR反應，并用2-ΔΔCt法計算基因表達量。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Real-time quantitative PCR primer sequence

1.4 數據分析與處理

所有實驗均進行三次重復，結果均以平均值±標準誤差（Mean ± SE）表示，使用IBM SPSS Statistics 23 軟件進行分 析，GraphPad Prism 9.0 作圖。當數據符合正態分布時使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和獨立樣本t檢驗，不符合正態分布時采用Kruskal-Wallis 和Mann-Whitney 檢驗，以P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）方法對體質量和肌肉類型進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同體質量黃鰭金槍魚糖原含量差異分析

如圖1所示，與小魚組相比，紅肌糖原含量在中魚組和大魚組顯著增加，且在大魚組達到最大值（F=168.435，P＜0.001）。白肌糖原含量在中魚組最高，在大魚組最低，且在三個體質量組中，紅肌的糖原含量均極顯著高于白肌（小魚F=5.876，P=0.009；中魚F=2.115，P＜0.001；大魚F=0.846，P＜0.001）。

圖1 不同體質量(小、中、大)黃鰭金槍魚糖原含量Fig.1 Glycogen content in Thunnus albacares with different body mass(small,middle,and large)

2.2 不同體質量黃鰭金槍魚無氧代謝關鍵酶活性和基因表達量差異

與無氧代謝相關的關鍵酶HK、PK、LDH 和PFK的酶活性測定和相關基因hk、pk、ldh和pfk的表達結果如圖2 所示。紅肌和白肌中HK 活性均在大魚組最高，且顯著高于小魚組和中魚組（紅肌F=72.627，P＜0.001；白肌F=168.730，P＜0.001）。除小魚組外，中魚和大魚組白肌的HK 活性顯著高于紅肌（中魚F=1.249，P=0.022；大魚F=2.638，P=0.007）（圖2(A)）。紅肌和白肌中PK 活性均在大魚組最高（紅肌F=17.466，P=0.003；白肌F=51.567，P＜0.001），且大魚組白肌PK 活性顯著高于紅肌（F=2.067，P=0.018）（圖2(C)）。紅肌和白肌中LDH 活性均在在大魚組最高，在小魚組最低（F=9.127，P=0.015），小魚組和中魚組紅肌和白肌LDH活性差異不顯著（小魚F=5.285，P=0.986；中魚F=0.606，P=0.309），但大魚組白肌LDH 活性顯著高于紅肌（F=4.747，P=0.020）（圖2(E)）。紅肌中PFK 活性差異不顯著（F=2.374，P=0.174），與小魚組相比，大魚組白肌中PFK 活性增加。除小魚組外，白肌中PFK 活性均顯著高于紅肌，并且在中魚組差異最大（F=1.614，P=0.006）（圖2(G)）。

圖2 不同體質量（小、中、大）黃鰭金槍魚無氧代謝關鍵酶活性和基因表達Fig.2 Activities of key enzymes and gene expression in anaerobic metabolism of Thunnus albacares with different body mass(small,middle,and large)

對應基因的表達結果顯示，紅肌中大魚組hk基因表達量顯著高于其他兩組（H=7.101，P=0.029），白肌中中魚組hk基因表達量最高，并且極顯著高于紅肌（Z=-3.991，P＜0.001）（圖2(B)）。紅肌pk基因表達量在三個體質量組中差異不顯著（H=3.067，P=0.216），白肌中pk基因表達量在中魚組表達量最高，并且極顯著高于紅肌（Z=-4.160，P＜0.001）（圖2(D)）。三個體質量組中紅肌ldh基因的表達量無明顯差異（H=0.470，P=0.790），白肌中ldh基因的表達量在大魚組最高，并且顯著高于紅肌（Z=-3.235，P=0.001）（圖2(F)）。紅肌中中魚組和大魚組pfk基因的表達量顯著高于小魚組，且在中魚組表達量最高（H=8.031，P=0.018），白肌中pfk基因表達量與體質量變化整體差異顯著（H=6.568，P=0.037），且在三個體質量組中紅肌和白肌pfk基因表達量均無明顯差異（圖2(H)）。

2.3 不同體質量黃鰭金槍魚有氧代謝關鍵酶活性和基因表達量差異

與有氧代謝相關的關鍵酶CS、SDH 和MDH 的酶活性和cs、sdh和mdh三個基因的表達量結果如圖3所示。紅肌和白肌兩種組織中CS活性均在大魚組最高，且顯著差異（紅肌F=1529.123，P＜0.001；白肌F=17.047，P=0.003）。所有體質量組中紅肌CS活性均顯著高于白肌（小魚F=2.180，P=0.022；中魚F=0.813，P＜0.001；大魚F=12.463，P=0.004），（圖3(A)）。與小魚組和中魚組相比，大魚組紅肌和白肌組織中SDH 活性最高（紅肌F=212.623，P＜0.001；白肌F=81.969，P＜0.001）。小魚組和中魚組SDH 活性在紅肌和白肌之間沒有差異，大魚組紅肌SDH 活性顯著高于白肌SDH 活性（F=0.883，P=0.011）（圖3(B)）。紅肌和白肌組織中MDH活性均在大魚組最高，在小魚組最低，且差異顯著（紅肌F=43.606，P＜0.001；白肌F=14.848，P=0.005）。紅肌MDH 活性僅在小魚組顯著高于白肌（F=0.122，P=0.031），中魚組和大魚組無明顯差異（圖3(C)）。

圖3 不同體質量(小、中、大)黃鰭金槍魚有氧代謝關鍵酶活性和基因表達Fig.3 Activities of key aerobic enzymes and gene expression in Thunnus albacares with different body mass(small,middle,and large)

有氧代謝關鍵酶cs、sdh和mdh三個基因的表達量測定結果顯示，紅肌和白肌中cs基因的表達量在中魚組顯著高于小魚組和大魚組（紅肌H=10.051，P=0.007；白肌H=17.351，P＜0.001），并且在大魚組紅肌cs基因的表達量顯著高于白肌（Z=2.102，P=0.034）（圖3(D)）。紅肌中sdh基因表達量在大魚組最高，且與小魚組差異顯著（H=9.462，P=0.009）；白肌中中魚組sdh基因表達量最高，顯著高于小魚組（H=17.983，P＜0.001），且在大魚組紅肌sdh基因的表達量與白肌sdh基因的表達量差異極顯著（Z=2.922，P=0.002）（圖3(E)）。與小魚組相比，中魚和大魚組紅肌和白肌mdh基因的表達量顯著增加（中魚H=9.145，P=0.010；大魚H=21.528，P＜0.001），但三個體質量組紅肌和白肌之間mdh基因表達量無明顯差異（小魚Z=-1.807，P=0.076；中魚Z=-1.084，P=0.300；大魚Z=0.230，P=0.847）（圖3(F)）。

2.4 不同體質量黃鰭金槍魚代謝酶活性和基因表達量方差分析

關鍵代謝酶活和基因表達測定方差分析結果如表3 所示。體質量、肌肉類型以及體質量×肌肉類型3 種效應會顯著影響HK、PFK、CS、SDH 活性和糖原含量（P＜0.05）。PK活性的體質量和肌肉類型的主效應差異顯著（P＜0.05），體質量×肌肉類型交互作用不顯著（P＞0.05）。LDH 活性的體質量主效應差異顯著（P＜0.05）。MDH活性的肌肉類型主效應差異不顯著（P＞0.05），體質量主效應和體質量×肌肉類型交互作用差異顯著（P＜0.05）。

表3 酶活性和基因表達測定的方差分析結果Table 3 ANOVA results of enzyme activity and gene expression determinations

基因表達量與體質量，肌肉類型和體質量×肌肉類型交互作用對hk、ldh、pfk、cs、sdh和mdh的基因表達量差異均不顯著（P＞0.05）。pk基因的表達量與體質量主效應，肌肉類型主效應和體質量×肌肉類型交互作用差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

3.1 不同體質量黃鰭金槍魚糖原含量差異

動物機體中，葡萄糖主要以糖原的形式儲存在肌肉組織，代謝時會迅速產生能量，供給肌肉收縮，因此肌肉組織的糖原的水平可以反映魚體糖代謝的狀態[20-22]。魚類的兩種肌肉組織具有不同的生理功能和代謝過程，白肌中糖代謝為分解代謝，糖酵解能力較高；紅肌中糖代謝為合成代謝，糖原合成較多[23-24]。此外，也有研究表明，白肌中葡萄糖代謝遠高于紅肌[25]。在本研究中，紅肌中糖原含量在大魚組最高，且顯著高于白肌組織，表明紅肌比白肌具有更高的合成糖原能力，可為黃鰭金槍魚的持續游泳運動儲存能量[26]。另外，本研究也發現大魚組白肌組織中糖原含量下降，表明白肌中糖原分解，為后續肌肉的無氧糖酵解代謝提供充足的能量底物[27]。

3.2 不同體質量黃鰭金槍魚無氧代謝酶活性及相關基因表達差異

HK、PK、LDH 和PFK 是無氧代謝途徑的關鍵酶，其活性可作為判別組織無氧代謝能力的指標。本研究發現，紅肌和白肌組織中HK、PK 和LDH 活性均在大魚組達到最大值，這與Davies 等[28]、Churova 等[29]的研究結果相似。同時，本研究發現大魚組中白肌的HK、PK 和LDH 活性均顯著高于紅肌，表明當黃鰭金槍魚個體體質量較大時，白肌組織具有較高的無氧代謝能力從而應對高度劇烈運動時的能量需求。PFK 是糖酵解途徑的關鍵酶，本研究發現白肌組織中體質量越大，PFK 活性越高，該結果與大西洋鱈（Gadus morhua）[30]的研究結果相似，表明體質量會影響糖酵解酶PFK 活性，從而促進機體的無氧代謝能力。另外，筆者也發現體質量是影響HK、PK、LDH 和PFK 活性表達的主要因素。研究表明，糖酵解酶可能在蛋白質合成的所有階段受到基因調控[31]。若酶活性與基因表達水平變化趨勢同步，表明酶活性與基因轉錄調有關[32]，不一致，則可能存在多種復雜調控機制[28]。本研究發現，白肌hk和pk基因表達量在小魚組、中魚組與相應的酶活性變化一致，而在大魚組變化不一致，該結果同樣體現在不同體質量的虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[33]上，表明黃鰭金槍魚在一定體質量范圍內，HK 和PK 活性受hk和pk基因轉錄調控調節。但魚體體質量較大時，hk和pk基因的表達量出現下降，這可能與白肌中糖酵解水平下降有關。本研究中白肌組織中ldh基因的表達量與白肌中LDH活性表達趨勢相一致，表明在個體發育過程中，白肌LDH 活性的差異與基因轉錄調控有關[28]。本研究還發現不同體質量組pfk基因與酶的活性表達完全不一致，推測可能pfk與PFK 活性之間存在復雜的轉錄調控機制[34]。

3.3 不同體質量黃鰭金槍魚有氧代謝酶活性及相關基因表達差異

魚類在生長發育的過程中大部分依賴于有氧代謝提供能量[35]。CS、SDH 和MDH 是三羧酸循環途徑的關鍵酶，可以用來評定組織的有氧代謝能力。本研究發現，隨著黃鰭金槍魚體質量的增加，紅肌和白肌組織中CS、SDH 和MDH 活性顯著增加，在大西洋鱈（G.morhua）[36]和黑鮪（Euthynnus lineatus）[37]中有相似結果，表明黃鰭金槍魚體質量的增加會促進有氧代謝酶CS 活性的表達。同時，本研究發現不同體質量組黃鰭金槍魚紅肌組織CS活性顯著高于白肌組織，表明紅肌組織具有更高的有氧代謝能力，以應對持續的肌肉收縮所需的能量[38]。另外，筆者也發現，體質量差異是影響CS、SDH 和MDH 活性表達的主要因素。在本研究中，sdh、mdh的基因表達量與SDH、MDH 酶活性的表達相一致，并隨著體質量的增加呈現先增加后穩定趨勢，表明sdh、mdh基因轉錄調控SDH、MDH 活性的表達。此外，本研究也發現，cs基因表達量隨體質量的增加呈現先增加后下降趨勢，與CS 活性表達不一致，此研究結果與Burness等[33]和Dalziel等[39]研究結果相似，可能是隨著黃鰭金槍魚體質量的增加，魚體內翻譯效率更高，轉錄產生更多的蛋白質，從而維持CS活性所需基因表達量較少所致[40]。

4 結論

在本研究中，與小魚組相比，大魚組紅肌中糖原含量顯著升高，白肌中糖原含量顯著下降，并且在不同體質量組中紅肌糖原含量均顯著高于白肌，表明不同體質量黃鰭金槍魚肌肉組織糖代謝能力差異。體質量的增加會促進肌肉組織中代謝酶活性的表達，其中白肌中無氧代謝關鍵酶（HK、PK、LDH、PFK）活性高表達，紅肌中有氧代謝關鍵酶（CS、SDH、MDH）酶活性高表達，并且體質量是影響酶活性表達的主要因素。另外，對酶活基因表達定量分析，發現體質量會影響基因表達，并且基因表達與酶活性之間存在復雜調控機制，此部分尚需進一步深入研究。