兩個復合雜合突變導致遺傳性凝血因子V缺陷癥家系的表型與基因突變分析

鄭周，徐琦煜，周星星，王明山，謝耀盛

溫州醫科大學附屬第一醫院 醫學檢驗中心 浙江省檢驗診斷及轉化研究重點實驗室，浙江 溫州 325015

凝血因子V（coagulation factor V, FV）是一種由肝細胞和巨核細胞產生的單鏈糖蛋白，由 2 196個氨基酸組成。它可被凝血酶和活化的凝血因子X（active coagulation factor X, FXa）水解，生成活化的凝血因子V（active coagulation factor V, FVa）[1]。FVa在凝血酶原復合物中作為FXa的膜受體，可以增強FXa的催化活性，促進凝血酶原激活[2]。 此外，FV還作為活化蛋白C（activated protein C,APC）的輔助因子具有抗凝作用，可以滅活活化的凝血因子VIII（active coagulation factor VIII,FVIIIa）[3]，但這一功能在FV被激活促凝期間不會表現出來[4]。遺傳性FV缺陷癥是一種罕見的常染色體隱性遺傳的出血性疾病，在普通人群中的發病率為百萬分之一[5]，可表現為無癥狀或鼻衄、口腔黏膜出血、月經量過多以及手術后異常出血等。根據FV活性（FV activity, FV:C）和FV抗原（FV antigen,FV:Ag）降低的程度，遺傳性FV缺陷癥分為I型數量缺陷型（FV:C和FV:Ag均降低）和II型質量缺陷型（FV:C降低但FV:Ag正常）兩種類型[6]。筆者報道兩例遺傳性FV缺陷癥家系，分析各成員臨床表型和基因型，結合生物信息學軟件預測結果，初步探討該兩個家系可能的分子致病機制。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者A，男，52歲，因“發現肺結節4 個月”至溫州醫科大學附屬第一醫院準備手術治療。術前常規出凝血檢測發現其凝血酶原時間（prothrombin time, PT）和活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time, APTT）延長。進一步的凝血因子活性檢測發現其FV:C和FV:Ag均降低，其他凝血指標無明顯異常。將先證者及家系其他成員共3代10人納入調查，發現其妹妹在分娩期間曾出現過異常出血，其余家系成員目前均無相關臨床癥狀，家系圖譜見圖1。

圖1 遺傳性FV缺陷癥家系圖（家系A）

圖2 遺傳性FV缺陷癥家系圖（家系B）

為建立相關凝血指標的實驗室參考范圍，招募篩選100名健康體檢者為正常對照組。男58名，女42名，平均年齡（35±12）歲，均無糖尿病及心血管疾病，無肝腎疾病，無出血或血栓性疾病病史。本研究獲得溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準（倫理批準號：2016-192），研究對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：外周血樣本采集自兩名先證者及其家系成員，采集于2.7 mL的枸櫞酸鈉（濃度為109 mmol/L）抗凝劑管，4 ℃ 2 100×g離心10 min， 制備上清乏血小板血漿和下層血細胞。血漿用于檢測凝血指標，下層血細胞用于DNA基因組提取。

1.2.2 血漿凝血指標測定：采用一期凝固法測定PT、APTT、FV:C、凝血因子II活性（coagulation factor II activity, FII:C）、凝血因子VII活性 （coagulation factor VII activity, FVII:C）和凝血因子X活性（coagulation factor X activity,FX:C），測定儀器為STA-R-Max血凝分析儀（法國Stago公司），采用Stago公司原裝試劑。FV:Ag使用ELISA試劑盒（美國Cedarlane Laboratories公司）并嚴格按試劑說明書測得。

1.2.3F5基因分析：所有家系成員的基因組DNA均使用DNA血液提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]從外周血細胞中提取。參照文獻[5]設計引物序列和PCR反應條件，通過PCR擴增先證者F5基因的所有外顯子及其側翼序列。PCR產物經過提純后由上海陽光生物技術股份有限公司進行測序。在確定相關突變位點后，擴增其所有家庭成員F5基因的相關外顯子以確認是否攜帶同樣的突變。

1.2.4 比對分析：使用多序列比對軟件ClustalX-2.1-win，分別以多種比對模式分析FV 蛋白中Ser111 的保守性。共研究了9 個同源物種：人類（NP_000121.2）、小鼠（NP_032002.1）、大鼠 （NP_001041343.1）、黑猩猩（XP_513984.4）、長尾猴（XP_001093072.2）、家犬（XP_005622605.1）、黃牛（NP_776304.1）、雞（XP_001231901.3）和斑馬魚（NP_001007209.2）。同源序列比對完成后，再進行保守性分析。

1.2.5 生物信息學分析：通過4 種在線生物信息軟件PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml）、PROVEAN（https://www.jcvi.org/research/provean）、Mutation Taster（https://www.mutationtaster.org/）和SIFT（http://sift.jcvi.org）來預測p.Ser111Ile突變對蛋白質功能的影響。根據UniProt（https://www.uniprot.org/）中已知的FV蛋白結構（AF-P12259-F1），使用PyMOL軟件分析了突變前后FV蛋白質空間結構的差異。整個蛋白質模型以卡通模式展示，突變位點氨基酸及與它們相互作用的氨基酸則以不同顏色的棒狀分子表示。

1.2.6 凝血酶生成實驗：參照文獻[7]，使用經校準的自動凝血酶生成實驗來檢測凝血酶的生成。按照荷蘭Thrombinoscope BV公司提供的操作流程，使用美國Fluoroskan Ascent FL熒光讀數儀測定滯后時間、峰高、峰值時間和內源性凝血酶潛能來評估FV的促凝活性，采用的試劑為FluoCa試劑盒和PPP試劑盒（法國Stago公司），使用的PPP試劑為中等組織因子濃度。

文學翻譯領域，學界圍繞“何為翻譯”、“如何翻譯”等問題展開了長久探討。嚴復曾提出“譯事三難”：信、達、雅，對譯者之為譯者所應具備的基本素養及翻譯倫理進行了細致探討；奈達曾主張“形式對等”、“功能對等”，就翻譯實踐中貼近源語還是貼近譯入語問題進行了探討。

2 結果

2.1 表型檢測結果 先證者A的APTT和PT均延長，其FV:C和FV:Ag均降低（分別為13%和20%），其父親、母親、妹妹、兒子和女兒的FV:C和FV:Ag也有所降低。先證者B的APTT和PT也均延長，其FV:C和FV:Ag也顯著降低（分別為3%和5%），其父親、母親、兒子和女兒的FV:C和FV:Ag也都有所降低，見表1。

表1 兩個遺傳性FV缺陷癥家系的表型和基因型檢測結果

2.2 基因型檢測結果 家系A的基因分析顯示，先證者A第3 外顯子存在c.332G＞T雜合錯義突變（p.Ser111Ile）；第25 外顯子存在c.6665A＞G雜合多態性（p.Asp2222Gly）。查閱gnomAD數據庫未發現p.Ser111Ile錯義突變，排除了多態性可能，并且在HGMD數據庫和PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中也未發現此錯義突變。家系研究表明，先證者的母親、妹妹和兒子均為p.Ser111Ile雜合子，其父親和女兒則是p.Asp2222Gly雜合子。家系其他成員為野生型。見圖3。

圖3 兩個遺傳性FV缺陷證家系的基因測序圖

家系B的基因分析顯示，先證者B第3 外顯子存在c.286G＞C雜合錯義突變（p.Asp96His）；第13 外顯子存在c.2393-2393delC雜合缺失突變（p.Pro798Leufs*13）。家系研究表明，先證者的父親和女兒均為p.Asp96His雜合子，其母親和兒子則是p.Pro798Leufs*13雜合子，其丈夫為野生型（見圖3）。

根據A C M G 變異評級指南，c.3 3 2 G ＞T（p.Ser111Ile）變異評級為意義不明確的（PM2+PP1+ PP3+PP4），具體證據項如下：①正常人群數據庫中未發現該變異（PM2）；②在該家系中除了先證者，其母親（I2）、妹妹（II4）及兒子（III2）中也均檢測到此變異（PP1）；③保守性分析顯示p.Ser111在多種同源物種中高度保守；SIFT、Polyphen-2和 M u t a t i o n T a s t e r 在線生物信息學軟件對p.Ser111Ile的預測結果分別為0.001分、0.999分和0.935分，顯示為致病變異（PP3）；④先證者的PT和APTT明顯延長，FV:C和FV:Ag均明顯降低，家族史也高度符合遺傳性FV缺陷癥（PP4）。

2.3 保守性軟件分析結果 在完成序列比對后，對Ser111進行序列保守性分析。使用ClustalX-2.1-win軟件對九個物種的同源序列進行比較，發現這些物種的Ser111序列高度保守（圖4）。Asp2222的保守性分析顯示也是保守的。

圖4 Ser111序列保守性分析

2.4 生物信息學軟件分析結果 通過在線軟件SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster和PROVEAN對p.Ser111Ile錯義突變的致病性進行預測，預測結果依次為“有害”“可能有害”“致病”和“有害”。p.Pro798Leufs*13和p.Asp2222Gly的致病性分析顯示均為“有害”，與陳元等[7]的研究一致。

通過PyMOL軟件對FV的蛋白質模型進行分析發現：野生型的Ser111 位于A1 區域，與Tyr66、Gly125、Ser174 和His175 通過氫鍵相連接。當Ser111突變為Ile111時，Ile111與Gly125和His175之間的氫鍵消失（圖5）。

圖5 p.Ser111Ile的模型分析

Pro798位于FV蛋白的B區域，當p.Pro798Leufs* 13發生突變時，會導致FV蛋白中的13個氨基酸發生移位以及下游Leu1010處氨基酸合成提前終止，最終導致B區域的一部分以及整個A3、C1、C2區域的缺失（圖6）。

圖6 p.Pro798Leufs*13的模型分析

2.5 凝血酶生成實驗結果 與健康對照組相比，先證者A和B的凝血酶生成量和峰值均明顯降低，而且達峰時間和凝血酶生成時間均延長。另外根據凝血酶生成曲線所示p.Arg2222Gly多態性與p.Ser111Ile、p.Asp96His和p.Pro798Leufs*13雜合子相比，在凝血酶生成量和峰值方面表現更高（圖7）。

圖7 家系A和B凝血酶生成實驗

3 討論

人類凝血因子V基因（F5）位于染色體1q23區域，由25個外顯子組成，編碼A1-A2-B-A3-C1-C2不同的結構域。每個結構域在FV蛋白中具有不同的功能。A1結構域有助于FVa/FXa相互作用和FVa重輕鏈之間的結合，A2結構域有多個凝血酶和APC水解作用位點，而C1和C2結構域提供了與磷脂及質膜的相互作用平臺[8-9]。但B結構域在同源物種中變化較大，并在FV活化為FVa的過程中被除去，后者由兩個Ca2+和一個Cu2+的非共價連接的重鏈（A1-A2結構域）和輕鏈（A3-C1-C2結構域）組成[10]。該排列方式可防止結構域被破壞，并穩定A1/A3鏈接處的結合。

本研究顯示，在家系A中發現了p.Ser111Ile和p.Asp2222Gly多態性兩種F5基因突變，在家系B中發現了p.Pro798Leufs*13和p.Asp96His兩種F5基因突變。這兩個家系的四種雜合突變均表現出FV:C和FV:Ag的同步降低，屬于I型FV缺陷癥。凝血酶生成試驗表明，F5基因缺陷患者的凝血酶生成數量均有所下降，其中以先證者A和先證者B的凝血功能下降最為明顯。因此，本研究認為這兩個家系中FV水平的下降與F5基因缺陷有關。

Ser111位點位于A1結構域中，其中所有配體均與Ca2+完全協同[11]。此外，ADAMS等[11]還認為A1結構域中可能存在一個由Lys121-Asp140組成的環，其空間構象使得A1和A3 結構域之間存在多個重要相互作用，增加了重鏈和輕鏈結合的穩定性，破壞這個結構可能會導致FVa的輕鏈和重鏈分離。保守性分析顯示，Ser111在生物進化中高度保守，表明它是凝血因子V蛋白質的一個重要的功能位點。通過構建FV蛋白質的結構模型，本研究發現Gly125位于Lys121-Asp140的環上，并且與Lys121在空間上相鄰。改變Ile111與Gly125之間的氫鍵以及擴展的側鏈可能會破壞Lys121的空間構象，影響環結構的穩定性，可能會導致FVa的重鏈和輕鏈分離。有文獻[12]報道了一個p.His175Arg變異體，影響了His1845的正常構象，導致FV活性降低。His1845是A1和A3結構域之間Cu2+配位的殘基，在FV蛋白質中與His175在空間上相近[13]。本研究的p.Ser111Ile突變鮮見報道，通過本研究發現Ile111和His175 之間氫鍵改變可能影響His175空間構造的穩定性，進而影響His1845。因此，這些氫鍵變化可能導致FVa的穩定性下降，從而加速FVa的降解，最終導致FV水平下降。

本研究發現FV的p.Asp2222Gly多態性與R2單倍型形成有關[14]。YAMAZAKI等[15]研究認為p.Asp2222Gly使得FV蛋白質的錯誤折疊，進而導致蛋白質在內質網中滯留，最終在細胞內被降解。值得注意的是，在家系B中發現的p.Arg96His具有與p.Asp2222Gly多態性相似的致病機制。有文獻報 道[16]認為這種突變可能會改變Arg96與Arg4之間的氫鍵，進而導致FV蛋白質的錯誤折疊并在內質網中滯留，最終在細胞內被降解。因此，p.Asp2222Gly多態性和p.Arg96His突變都顯示出FV表達的不穩定和FV蛋白質分泌速率降低，這可能是p.Asp2222Gly和p.Arg96His雜合子中FV:Ag降低的原因。本研究的p.Pro798Leufs*13突變最早見于DENG等[7]報道，認為它是一種致病的突變體，可能會對FV蛋白質的功能和結構造成損害。根據本研究的蛋白質結構模型可知，p.Pro798Leufs*13突變可直接導致FV蛋白質合成提前終止，形成了截斷蛋白。而這種截斷蛋白對生物體是有害的[17]，并且其在細胞內更容易被降解，最終導致FV蛋白質分泌減少以及機體內FV水平減低。

綜上所述，本研究中發現的四種突變p.Ser111Ile和p.Asp2222Gly、p.Arg96His和p.Pro798Leufs*13的復合雜合突變與兩個家系的遺傳性FV缺陷癥有關，并且可能是造成兩個家系FV水平下降的主要原因。本研究采用生物信息學軟件預測突變危害性和建立突變蛋白模型，對p.Ser111Ile和p.Pro798Leufs*13突變潛在致病機制進行了初步研究，但具體的致病機制需要通過體外表達實驗做進一步的探討。