哮喘兒童TLR4基因多態性與其外周血炎癥因子及肺功能水平的相關性研究

王字卉,李權倫,散 琴

(湖北省十堰市婦幼保健院檢驗科,湖北 十堰 442000)

支氣管哮喘是涉及多種細胞和炎性因子參與的以氣道慢性炎癥為特征的疾病,這種慢性炎癥與氣道高反應性相關[1-3]。據不完全統計我國的兒童哮喘患病率呈逐年增長的趨勢,哮喘不僅影響青少年兒童的發育和身體健康,而且影響兒童的心理健康,因此有效的預防和早期的診療,對減少兒童哮喘的發生具有重要意義[4-5]。研究顯示哮喘的發生發展與多個基因和環境因素密切相關[6-8],Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)為單個的跨膜蛋白,能夠識別病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[9-11],作為Toll樣受體家族成員之一的TLR4近年來受到研究者的廣泛關注。TLR4能夠識別細菌細胞壁中的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),并可調節Th1/Th2的平衡,影響體內白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)水平[12-13],其與哮喘的發生發展密切相關,但TLR4基因多態性與兒童哮喘及患兒病情預后之間的關聯尚不明確,本研究旨在探索哮喘兒童外周血IL-4和IFN-γ水平及其與Toll樣受體4基因多態性的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019年4月至2022年10月湖北省十堰市婦幼保健院收治的172例急性發作期哮喘患兒為實驗組,納入標準:①年齡為6～14周歲;②診斷標準按照2020版《兒童支氣管哮喘規范化診治建議》[14];③無心肺、肝臟、腎臟等器官的功能障礙;④無其他自身免疫缺陷癥疾病或者先天性疾病。根據患兒哮喘的嚴重程度,將實驗組分為輕度、中度、重度和危重。選擇同期在本院兒童保健科門診體檢的136例兒童作為對照組,研究對象均為漢族人群。本研究通過十堰市婦幼保健院倫理委員會審查,所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑及材料

IL-4、IFN-γ測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司,DNA提取試劑盒購自大連寶生生物工程有限公司,低溫離心機購自Thermo Scientific公司,PCR儀購自Bio-Rad公司,DYY-6C電泳儀購自北京六一儀器廠,引物設計及合成購自上海生工生物工程公司,凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司,血細胞分析儀為深圳邁瑞公司,NO分析儀購自江蘇無錫尚沃公司。

1.3 研究方法

1.3.1 標本的采集及處理

收集納入患者的年齡、性別、體質量指數(body mass index,BMI)等一般資料,于患者入院24h內采集患者外周血3mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)真空抗凝管,混勻,離心(3 000r/min)10min,分離血漿和細胞,-80℃低溫冰箱保存備用。

1.3.2 各項臨床指標檢測

采用酶聯免疫吸附法測定血漿中的IL-4、IFN-γ水平,測定的方法嚴格按照碧云天公司產品試劑盒說明書進行操作,利用血細胞分析儀測定外周血嗜酸性粒細胞百分比(eosinophils,Eos),利用化學發光法檢測血清總免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE),利用便攜式肺功能儀和NO分析儀,指導受試者進行肺功能指標一秒率(forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity,FEV1/FVC)和呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)測定,共測定3次,取最佳值。

1.3.3 TLR4基因多態性的測定

按照DNA提取試劑盒說明書操作規程,快速抽提全血基因組DNA,檢測樣本吸光度值A260/A280介于1.6～1.8,將提取的樣本DNA于-80℃低溫冰箱保存,采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction,PCR-RELP)技術對TLR4基因多態性的檢測分析,上下游引物見表1。PCR擴增條件:95℃預變性5min,95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,循環30次,之后72℃延伸5min。PCR擴增產物用限制性內切酶進行酶切,酶切產物在3.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,然后通過Bio-Rad凝膠成像系統觀察結果,判斷樣本的基因型。

表1 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile上下游引物

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組一般資料比較

實驗組、對照組在性別、年齡、BMI方面比較差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 各組間一般資料比較

2.2 對照組和實驗組臨床相關指標比較

實驗組哮喘患兒外周血中IL-4、Eos、IgE、FeNO的水平高于對照組,而IFN-γ、FEV1/FVC(%)水平低于對照組,差異均有統計學意義(t值介于8.90～29.04之間,P<0.05),見表3。

表3 對照組和實驗組臨床相關指標比較

2.3 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位點單核苷酸多態性遺傳平衡檢驗

TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位點單核苷酸多態性的預期基因型頻率處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),樣本具有群體代表性;實驗組與對照組TLR4基因多態性位點Asp299Gly的基因型和等位基因分布相比,差異不具有統計學意義(P>0.05);實驗組Thr399Ile單核苷酸多態性位點TT基因型分布頻率高于對照組,T等位基因分布頻率高于對照組,差異有統計學意義(χ2值分別為10.19、11.50,P<0.05),見表4。TLR4基因Thr399Ile位點PCR-RFLP電泳圖譜(29bp條帶在瓊脂糖凝膠電泳中未能顯示出)見圖1。

注:Lane1、Lane4為CC基因型(406bp);Lane2為CT基因型(406bp、377bp、29bp);Lane3、Lane5為TT基因型(377bp、29bp);29bp條帶在瓊脂糖凝膠電泳中未能顯示出。

表4 各組TLR4基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及分布頻率的比較 [n(%)]

2.4 TLR4基因Thr399Ile多態性和哮喘患兒臨床相關指標比較

攜帶Thr399Ile TT基因型哮喘患兒的IL-4和FeNO水平高于CC和CT基因型,IFN-γ的水平低于CC和CT基因型,差異有統計學意義(F值分別為44.95、24.29、8.51,P<0.05);TLR4基因Thr399Ile多態性與哮喘患兒Eos、IgE的水平、FEV1/FVC(%)無相關性(P>0.05),見表5。

表5 TLR4基因Thr399Ile多態性和兒童哮喘臨床相關指標比較

2.5 TLR4基因Thr399Ile多態性和患兒哮喘嚴重程度比較

秩和檢驗顯示攜帶Thr399Ile 單核苷酸多態性位點基因型與哮喘發病程度不相關,差異無統計學意義(P>0.05),見表6。

表6 TLR4基因Thr399Ile多態性和患兒哮喘嚴重程度比較 [n(%)]

2.6 二元Logistic回歸分析TLR4基因Thr399Ile位點的單倍體基因型與兒童哮喘的相關性

共顯性模型中,TT基因型人群是CC型人群患病風險的2.353倍,其OR值及95%CI為2.353(1.575～4.663),P<0.05;顯性模型中,CT+TT基因型人群是CC型人群患病風險的1.962倍,其OR值及95%CI為1.962(1.228～3.206),P<0.05;隱形模型中,TT基因型人群是CC+CT型人群患病風險1.875倍,其OR值及95%CI為1.875(1.258～3.059),P<0.05,見表7。

表7 二元Logistic回歸分析TLR4基因Thr399Ile位點與兒童哮喘的關系

3 討論

3.1 兒童哮喘的致病機理

哮喘是兒童比較常見的疾病之一,主要與遺傳和環境因素相關,是受多個基因調控而引起的免疫功能紊亂的氣道高反應炎癥,研究表明哮喘患兒體內的細胞因子和免疫細胞水平異常,是Th1/Th2比例失衡導致的2型炎癥[15-16]。TLR是模式識別受體的一種,TLR具有單個的跨膜蛋白,可識別病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),是參與天然免疫的一類重要蛋白質分子。作為Toll樣受體家族成員之一的TLR4近年來受到研究者的廣泛關注。有研究表明,TLR4途徑可觸發NF-κB信號通路的活化,影響基因表達的調控,進而影響機體的炎癥因子和免疫細胞水平[17-18]。因此,本研究旨在探索哮喘兒童外周血IL-4和IFN-γ水平及其與Toll樣受體4基因多態性的相關性,為兒童哮喘的診療提供新的思路。

3.2 哮喘患兒外周血炎癥因子及肺功能水平分析

本研究選取172例哮喘患兒進行了分析,研究結果顯示,哮喘組患兒外周血中IL-4水平升高,IFN-γ水平降低,而IL-4主要由Th2淋巴細胞釋放,IFN-γ主要由Th1淋巴細胞釋放,說明哮喘患兒是機體內的Th1/Th2比例失衡導致的2型炎癥。此外,哮喘組患兒肺功能指標FEV1/FVC(%)顯著低于對照組,FeNO水平顯著高于對照組。FeNO是氣道上皮細胞及炎癥細胞的一氧化氮合酶催化L-精氨酸產生的,當氣道受外界刺激誘發2型炎癥時,可導致氣道上皮細胞中一氧化氮合酶表達增多,從而催化L-精氨酸產生更多的NO;是目前被廣泛認可的氣道2型炎癥的分子標志物,其不僅能反映氣道炎癥水平,還能預測評估抗炎效果。該檢測具有無創簡便的優點,在臨床上得到了廣泛的應用[19]。

3.3 哮喘患兒與TLR4基因多態性的相關性分析

通過進一步研究發現,TLR4基因Thr399Ile多態性與哮喘患兒外周血嗜酸性粒細胞百分比、IgE的水平、FEV1/FVC(%)無相關性,但攜帶Thr399Ile TT基因型哮喘患兒的IL-4和FeNO水平高于CC和CT基因型,IFN-γ的水平顯著低于CC和CT基因型。TLR4基因、IL-4、IFN-γ可能是哮喘輕癥進展成重癥的關鍵因子,FeNO水平可預測哮喘的嚴重程度。基因水平檢測發現,TLR4基因多態性位點Asp299Gly的基因型和等位基因分布差異不明顯,Thr399Ile的基因型和等位基因分布存在顯著差異,其中實驗組T等位基因分布頻率顯著高于對照組。二元Logistic回歸分析發現TLR4基因Thr399Ile位點的基因多態性與兒童哮喘存在相關性,TT基因型是兒童哮喘的獨立危險因素。但本研究納入樣本量較小,且并未進行多因素的分層分析,因此后續我們還需進一步擴大樣本量,同時進一步探索不同因素對TLR4基因多態性與兒童哮喘相關性的影響。

綜上所述,本研究發現TLR4基因Thr399Ile位點多態性與兒童哮喘的發生具有相關性,影響哮喘患兒IL-4、IFN-γ、FeNO的表達水平,但與哮喘患兒的肺功能水平和發病的嚴重程度無關。