NGAL及自噬在大鼠腎臟缺血/再灌注損傷中的表達及意義

張雅麗 張 敏 邢曉英 孫萌萌 齊冉 喬淑凱

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是一個全球性的公共衛生問題,與高發生率、高病死率和高醫療成本相關,腎臟缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是發生AKI的重要原因,腎損傷早期功能尚可恢復,如果損傷進一步加重可進展至腎衰竭狀態,腎功能難以恢復,目前臨床缺乏有效的治療方法,仍以血液透析、腎臟替代治療等為主,醫療費用高。因此,尋找早期腎損傷標志物以及具有腎臟保護作用的干預方法顯得尤為重要。

近年來,中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutmphil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)作為早期AKI的生物學標志物備受關注[1～3]。NGAL屬載脂蛋白超家族成員,生理狀態下可在多種正常組織中表達,在某些良性疾病和惡性腫瘤中呈異常高表達。目前,有關NGAL的功能及其在I/R損傷方面的作用尚缺乏系統研究。有研究發現,缺氧和缺血性腎損傷均可誘導自噬發生,但是自噬在I/R損傷中的作用仍需進一步證實[4]。本研究通過建立大鼠腎臟I/R損傷模型,明確在NGAL及自噬在大鼠腎臟I/R損傷過程中的表達情況,旨在探討NGAL表達及自噬狀態在腎臟I/R損傷中發揮的作用。

材料與方法

1.實驗動物及分組:30只SPF級健康雄性Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,體質量為250～300g,飼養在河北醫科大學第二醫院實驗動物中心。所有的實驗方案均經河北醫科大學第二醫院實驗動物倫理學委員會批準(倫理學審批號:2022-AE29)。大鼠購進后在SPF級動物房飼養1周,實驗前12h禁食、不禁水。將大鼠按隨機數字表法分為兩組,即假手術組(Sham組)和缺血/再灌注組(I/R組),I/R組按照恢復再灌注后不同時間分為4個亞組,分別是2h、6h、24h和48h,每組各6只。

2.模型建立:以戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,采用兩側背部切口剪開皮膚和肌層進腹,顯露右側腎臟及腎蒂血管,迅速切除右腎。左側腎臟血管分離后,無損傷動脈夾持續夾閉左腎動脈,肉眼觀腎臟迅速由紅潤變為紫黑色表明夾閉成功,45min后松開動脈夾行再灌注,恢復左腎血流,若灌注后5min內左腎由暗黑轉為紅潤則表示灌注成功。然后于再灌注后不同時間切取大鼠左腎留取組織標本,摘眼球法采取血標本,隨后脊椎脫臼法處死大鼠。Sham組僅游離左腎動脈但不予夾閉,余處理同I/R組。

3.腎功能檢測:上述各組大鼠均采取摘眼球取血的方法留取血液標本,置于離心管中,隨即在離心機上以3000r/min離心10min(離心半徑12cm),分別留取上層血清,利用Olympus AU2700全自動生化分析儀(日本奧林巴斯)檢測。

4.NGAL水平檢測:取上述各組大鼠的血液及尿液標本,然后應用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)檢測血清及尿液中的NGAL表達水平。具體步驟參閱試劑盒說明書。首先包被抗體,將捕獲抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度(0.8μg/ml),取100μl稀釋的抗體加入96孔酶標板中在室溫下孵育過夜。隨后封閉抗體,并分別加入血液及尿液標本,室溫孵育2h后檢測抗體,最后上機檢測,加入底物溶液并封板室溫孵育,充分顯色后加入50μl的終止液并在BIO-RAD 550型全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)上測定450nm處波長吸光度(A)值。

5.腎組織病理學評價:將各組大鼠腎組織標本經4%多聚甲醛固定,常規石蠟包埋,制作石蠟切片。石蠟切片在二甲苯中常規脫蠟至水,蘇木精染色10min,流水沖洗后伊紅染液染色2min,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察各組腎組織變化。各組大鼠腎損傷程度根據腎組織損傷積分進行評價,病理評分范圍為0～5分:正常為0分;損傷面積<10%為1分;損傷面積10%～25%為2分;損傷面積25%～50%為3分;損傷面積50%～75%為4分;損傷面積≥75%為5分[5,6]。

6.原位末端標記法((TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)檢測腎小管上皮細胞凋亡情況:上述各組大鼠按要求于相應時間點切取左側腎臟,以無菌手術刀片做縱切面剖開,切取厚度約0.4cm的腎組織塊置于4%多聚甲醛中固定,常規石蠟包埋,制作石蠟切片。石蠟切片在二甲苯中常規脫蠟和水化后,根據檢測TUNEL試劑盒說明書操作,用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察,每張切片在高倍鏡下隨機觀察10個不重疊視野,對每個視野計數陽性細胞個數,綠色熒光發亮者為凋亡細胞,于凋亡細胞分布區域,隨機選取5個視野,熒光顯微鏡下計數凋亡細胞數。

7.實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測自噬相關基因表達情況:將各組腎組織標本用研缽充分研磨并離心。Trizol法提取細胞總RNA,用紫外分光光度計測定吸光度A260/A280比值均>1.8,并根據A280為1≈40mg/L RNA進行含量測定。配制25μl反轉錄體系,獲取cDNA備用。所有引物及反應條件參考相關文獻[7],并核對GenBank中原始cDNA序列,經生工生物工程(上海)股份有限公司鑒定并合成。配制PCR反應體系,反應條件:95℃預變性10min,然后95℃變性15s,60℃退火/延伸60s,40次循環結束。每個樣本的LC3、Beclin-1和內參β-actin的檢測均做3個平行管,以保證其結果的準確性。LC3和Beclin-1靶基因相對于內參β-actin的表達量用2-ΔCt表示。每個標本重復測定3次,結果取平均值。引物序列、擴增片段如下:LC3(NM 022867.2):上游引物:5′-CATGCCGTCCGAGAAGACCT-3′,下游引物:5′-GATGAGCCGGACATCTTCCACT-3′;Beclin-1(NM 001034117.1):上游引物:5′-TTGGCCAATAAGATGGGTCTGAA-3′,下游引物:5′-TGTCAGGGACTCCAGATACGAGTG-3′;β-actin (NM 006248886.1):上游引物:5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′,下游引物:5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

結 果

1.腎功能評價:大鼠經腎臟缺血恢復再灌注不同時間后,除2h組BU、SCr水平較Sham組無明顯升高外;6h組、24h組和48h組的BU、SCr水平較Sham組均明顯升高,說明大鼠腎臟I/R損傷模型建立成功,腎功能出現不同程度的異常。與Sham組比較,24h組和48h組的BU、SCr水平最高(P<0.01),說明其腎損傷程度加重,而48h組BU、SCr水平較24h組差異無統計學意義,證實腎臟缺血再灌注后24h損傷已經非常明顯,詳見圖1。

圖1 各組大鼠BU和SCr水平A.各組大鼠血BU水平;B.各組大鼠SCr水平。與Sham組比較,*P<0.01,**P<0.001

2.大鼠血及尿中NGAL的表達水平:ELISA法檢測結果顯示,與Sham組比較,缺血再灌注損傷后2h即可檢測出血及尿中NGAL不同程度地升高,6h組血及尿中的NGAL表達量升至最高,24h組及48h組NGAL表達有所下降,但仍高于正常,說明在腎損傷早期NGAL表達量即可升高并被檢測到,詳見圖2。

圖2 各組大鼠血清和尿液中NGAL表達量A.各組大鼠血清中NGAL的表達水平;B.各組大鼠尿液中NGAL的表達水平

3.腎組織形態學評價:腎組織切片蘇木精-伊紅染色結果顯示,Sham組腎組織結構未見明顯異常。隨著再灌注時間的延長,I/R組可見到腎小管上皮細胞不同程度損傷。I/R損傷后2h局部可觀察到腎小管上皮細胞腫脹,管腔擴張;I/R損傷后6h可有上皮細胞脫落、變性、刷狀緣消失等現象發生,部分腎小管管腔狹窄;24h后可有腎小管上皮細胞核固縮、碎裂等,出現變性甚至壞死,腎小管結構松散,輪廓不清晰,管腔內可見壞死脫落的細胞碎屑、大量紅細胞及蛋白管型出現;48h后部分病變的腎小管逐漸開始出現修復現象,可觀察再生的上皮細胞不斷增多,可見核分裂象,管腔內的細胞殘留物質有所減少(圖3A)。與Sham組比較,2h組、6h組、24h組和48h組病理損傷評分均明顯升高(圖3B)。

圖3 各組腎組織病理學改變及病理損傷評分A.各組腎組織病理圖片(HE染色,×200)。Sham組顯示正常腎組織結構;腎臟缺血后恢復再灌注不同時間的腎組織結構變化,如圖中藍色箭頭所示,2h組:管腔擴張,上皮細胞腫脹;6h組:上皮細胞脫落、變性;24h組:腎小管結構松散,輪廓不清晰,管腔內可見壞死脫落的細胞碎屑;48h組:管腔內的細胞殘留物質有所減少。B. 各組腎組織病理損傷評分。與Sham組比較,*P<0.05,**P<0.01

4.細胞凋亡檢測:TUNEL法檢測結果顯示,Sham組TUNEL染色陰性,幾乎未見細胞發生凋亡;而發生I/R損傷后可見到TUNEL染色陽性細胞,24h組和48h組陽性細胞明顯增多。與Sham組比較,6h組、24h組和48h組凋亡細胞數均明顯增多,而2h組可見到少數凋亡細胞數,但與Sham組比較,差異無統計學意義,詳見圖4。

圖4 各組腎組織TUNEL染色圖和TUNEL陽性細胞數A.有代表性的凋亡細胞免疫熒光圖片,TUNEL陽性細胞的細胞核被染成綠色(TUNEL染色,×200);B.平均每高倍視野的TUNEL陽性細胞個數。與Sham組比較,*P<0.05,**P<0.01

5.LC3、Beclin-1的mRNA表達水平:RT-qPCR檢測結果顯示,與Sham組比較,I/R組可檢測到LC3、Beclin-1的mRNA不同程度表達,說明大鼠腎臟I/R損傷后,自噬被激活。與Sham組比較,2h組雖能檢測到少量LC3、Beclin-1的mRNA表達,但差異無統計學意義(P>0.05),6h組、24h組和48h組均可檢測到明顯LC3、Beclin-1的mRNA表達(P<0.01),提示自噬處于激活狀態,詳見圖5。

圖5 各組LC3及Beclin-1的mRNA相對表達情況與Sham組比較,*P<0.05,**P<0.01

討 論

近年來,隨著腎臟手術、腎移植、心臟外科體外循環、休克后微循環再通等不斷增加,使許多組織器官缺血后重新得到血液再灌注,導致I/R損傷日益增多。腎臟是一個高灌注器官,對于再灌注損傷尤其敏感。本研究成功建立了大鼠腎臟I/R損傷模型,觀察在I/R損傷后不同時間腎功能及病理變化情況,以及在此過程中NGAL表達及自噬激活情況,為進一步探討NGAL及自噬對大鼠腎臟I/R損傷過程中的作用打下了基礎。

NGAL屬于載脂蛋白超家族成員,最初在活化的中性粒細胞中發現。NGAL參與機體多種生物學過程,如胚胎發育、細胞分化、炎癥及免疫反應、細胞凋亡、信號轉導、糖類脂質代謝等多種生理及病理過程[8～10]。本研究結果顯示,在大鼠腎臟I/R損傷后的不同時段,均可有不同程度的腎小管上皮細胞的腫脹、壞死,甚至核固縮、碎裂,伴隨有細胞凋亡的發生,證明本研究大鼠腎臟I/R損傷模型成功建立。進一步的研究結果表明,腎臟I/R損傷后傳統的腎損傷指標BU和SCr水平的升高與腎組織病理學損傷程度的變化趨勢具有一致性,均可用于評價腎臟I/R損傷的嚴重程度,但其弊端同樣不可忽略,BU及SCr值在腎臟I/R損傷后6h才開始升高,24h達到高峰,但病理學顯示腎臟I/R損傷后2h即可觀察到局部腎小管上皮細胞腫脹,管腔擴張,腎組織病理評分較Sham組已明顯升高,說明腎損傷已經發生,而此時BU及SCr值仍處于正常水平,當腎臟I/R損傷6h BU及SCr檢測到升高時,腎損傷已處于較為嚴重狀態,腎小管上皮細胞已經出現凋亡現象,而這種程度的損傷有時是不可逆的,因此,傳統的腎損傷指標BU及SCr在診斷時限上有明顯的延后性,導致臨床上有可能會喪失治療AKI的最佳時機。

在腎臟I/R損傷后2h即可檢測出血清及尿液中NGAL水平的升高,至6h時NGAL水平已升至最高,充分說明在腎損傷早期NGAL水平即可升高并被檢測到,更能真實、同步地反映腎損傷的嚴重性,從而驗證了NGAL可以作為早期診斷腎臟I/R損傷的理想分子指標,相關研究目前已經受到廣泛關注[11～13]。然而,NGAL表達水平的升高對于腎臟I/R損傷而言,究竟是發揮保護性作用還是進一步加重損傷,目前尚未有這方面的研究報道。因此需要進一步的研究來驗證NGAL對腎臟I/R損傷的作用以及可能涉及的機制。

I/R損傷可造成細胞功能障礙,同時可觸發凋亡、自噬和壞死。自噬又稱為Ⅱ型細胞死亡,是細胞在自噬相關基因(Atg)的調控下利用溶酶體降解自身受損的細胞器和高分子物質的過程。自噬可以清除細胞中損傷或衰老的細胞器及生物高分子,維持細胞的自我穩態。Beclin-1是一種獨特的自噬相關蛋白,在調解其他自噬蛋白形成預自噬體結構時的定位方面發揮重要作用。LC3是哺乳動物的同源酵母Atg8,也是自噬研究中最重要、最可靠的標志物[14]。本研究結果顯示,2h組檢測的LC3、Beclin-1的mRNA表達與Sham組比較,差異無統計學意義,腎臟I/R損傷后6h則可以檢測到LC3、Beclin-1的mRNA表達水平較Sham組顯著增加,提示自噬處于激活狀態。國外有研究顯示,腎臟I/R損傷后腎小管細胞中自噬激活,并在腎臟I/R損傷的細胞和動物模型中均得到證明,這與本研究結果基本一致[15～17]。

綜上所述,關于自噬對于腎臟I/R損傷的作用,國內外研究結果尚不一致。多數研究認為自噬參與腎臟I/R損傷,并起到保護性作用;但也有相反的觀點認為自噬雖然在腎損傷中扮演保護角色,但是過度自噬可加重腎細胞損傷或死亡。NGAL能否通過調控自噬對腎臟I/R損傷發揮保護作用,需開展進一步研究予以證實。