膽汁酸譜在早期非酒精性脂肪性肝病患者中的表達水平及臨床意義

孫亞麗 戴紅蕾

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)包括了非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝細胞癌。它是2型糖尿病、肝臟和心臟代謝疾病死亡的重要危險因素,其患病率在全球范圍內迅速上升,亞洲人群的患病率約為29.6%,NAFLD已成為中國最普遍的慢性肝病,也是中國體檢中肝酶升高的主要原因[1,2]。NAFLD 的主要原因尚未闡明,包括肥胖和胰島素抵抗在內的代謝綜合征被廣泛認為是NAFLD發病的關鍵危險因素,因此早期識別NAFLD并進行積極干預意義重大[3]。

膽汁酸是脂質代謝、葡萄糖穩態和能量消耗的重要調節劑,在肝臟病變早期,血清中的總膽汁酸不會發生明顯改變,而血清中各種亞型膽汁酸濃度將產生相應的變化,因此,不同的膽汁酸亞型對于肝病的篩查、診斷和鑒別診斷具有重要意義[4,5]。由于NAFLD與糖尿病之間的相互作用顯著,目前膽汁酸譜變化的研究多集中于糖尿病人群中,單純的NAFLD人群較少或多為動物實驗,本研究通過擬檢測早期NAFLD患者血清膽汁酸譜的變化,初步探討膽汁酸各組分對早期NAFLD患者病情診斷評估的意義。

對象與方法

1.研究對象:選取2021年7月～ 2022年2月于浙江大學醫學院附屬第四醫院體檢中心進行體檢的早期NAFLD患者149例(病例組),其中男性111例,女性38例,患者年齡26～72歲,平均年齡為45.0±0.8歲,以同時期進行健康體檢的無心、腦血管及肝、腎疾病的健康體檢者140例作為對照組,其中男性108例,女性32例,年齡22～71歲,平均年齡為45.4±0.9歲。兩組研究對象的年齡、性別比較,差異無統計學意義,具有可比性(P>0.05)。NAFLD 臨床診斷及超聲診斷標準參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010 年修訂版)》及2018 更新版[6,7]。NAFLD組納入標準:①年齡 18～75 歲;②B型超聲、受控衰減參數(controlled attenuation parameter,CAP)、X 線計算機斷層攝影術和磁共振成像等檢查診斷脂肪肝。排除標準:①過量飲酒史[過去12個月每周飲用乙醇(酒精)男性>210g,女性>140g];②應用了肝毒性藥物;③患有病毒性感染、自身免疫性肝炎、全胃腸外營養、β脂蛋白缺乏癥、先天性脂質萎縮癥、乳糜瀉等可以導致脂肪肝的疾病;④患有嚴重的心腦血管及肝腎疾病;⑤合并高血壓、糖尿病、膽囊結石、膽汁淤積、炎癥性腸病等其他可能影響膽汁酸譜結果的疾病;⑥排除肝硬化、肝癌的患者;⑦妊娠、哺乳期女性。本研究經浙江大學醫學院附屬第四醫院醫學倫理學委員會批準(倫理學審批號:k2022088),所有納入的研究對象均知情。

2.研究方法:搜集患者既往病史、吸煙史、飲酒史、肝功能及CAP信息,根據CAP數值將NAFLD組患者分為輕度組(CAP<259dB/m)、中度組(259～292dB/m)和重度組(CAP>292dB/m);患者于體檢當日空腹采集肘靜脈血3～4ml于黃色促凝采血管中,以3000r/min離心10min,離心半徑10cm,分離血清,采用液相色譜-串聯質譜法檢測膽汁酸(bile acid,BA),包括膽酸(cholic acid,CA)、甘氨膽酸(glycocholic acid,GCA)、牛磺膽酸(taurocholic acid,TCA)、脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)、甘氨脫氧膽酸(glycodeoxycholic acid,GDCA)、牛磺脫氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid,TDCA)、鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(glycochenodeoxycholic acid,GCDCA)、牛磺鵝脫氧膽酸(taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)、熊脫氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)、甘氨熊脫氧膽酸(glycineursodeoxycholic acid,GUDCA)、牛磺熊脫氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)、石膽酸(lithocholic acid,LCA)、甘氨石膽酸(glycocholic acid,GLCA)、牛磺石膽酸(taurolithocholic acid,TLCA)15種亞組分和總膽汁酸濃度,試劑盒購自杭州迪安科技有限公司,儀器型號為上海沃特世科技有限公司的Xevo TQD三重四極桿質譜。

結 果

1.兩組患者血清肝功能和膽汁酸譜的比較:早期NAFLD組患者天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase,AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT)水平均高于健康組,差異有統計學意義(P<0.05);早期NAFLD組患者血清CA、GCA、TCA、GDCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、GUDCA、TUDCA、TLCA水平高于健康組,LCA水平低于健康對照組,早期NAFLD組患者血清兩種形式的初級膽汁酸和總游離膽汁酸、總次級結合膽汁酸、總次級膽汁酸、總初級/次級膽汁酸、總膽汁酸高于健康對照組,總游離/結合膽汁酸低于健康對照組(P<0.05),詳見表1。

2.早期NAFLD組患者危險因素的二元回歸分析:以患者是否合并NAFLD作為因變量,選擇單因素分析差異有統計學意義的AST、ALT、r-GT、CA、GCA、TCA、GDCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、GUDCA、TUDCA、LCA、TLCA為自變量,經Logistic回歸分析,最終進入回歸方程的有AST、GCA、TCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、GUDCA、TLCA,回歸分析結果顯示AST、GCA、TCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、GUDCA、TLCA均為早期NAFLD的危險因素(P<0.05),詳見表2。

3.天門冬氨酸轉移酶和膽汁酸譜亞組分預測患者發生NAFLD的診斷效能:將二元回歸分析有意義的指標進行繪制ROC曲線,結果顯示顯示血清AST、GCA、TCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、GUDCA、TLCA預測NAFLD的ROC曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.750、0.699、0.692、0.605、0.686、0.647、0.631、0.618,最佳臨界點分別為25.2U/L、123.695nmol/L、24.940nmol/L、299.405nmol/L、1160.705 nmol/L、88.385nmol/L、149.57nmol/L、5.195 nmol/L,其中AST的綜合預測效果最好,GCA的敏感度最高,為77.2%,TLCA特異性最強,為88.6%,差異均有統計學意義(P均<0.05),詳見表3及圖1。

圖1 血清AST、GCA、TCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、GUDCA和TLCA預測患者發生早期NAFLD的ROC曲線

表3 血清AST、GCA、TCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、GUDCA和TLCA預測患者發生NAFLD的ROC曲線結果

4.膽汁酸譜亞組分在不同嚴重程度的NAFLD患者中的水平:將NAFLD組患者分為輕度組、中度組和重度組,比較3組患者血清GCA、TCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、GUDCA和TLCA水平,發現GCA、TCA具有組間差異,進一步進行組內兩兩比較,發現GCA、TCA在NAFLD重度組患者中較輕度組明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05),中度組與輕度組和重度組之間比較,差異均無統計學意義,詳見表4;進一步行Spearman分析,發現TCA與CAP相關系數r=0.52,在統計學上具有良好的相關性(P=0.008),而GCA與CAP相關系數r=0.35,差異無統計學意義(P=0.082)。

表4 GCA、TCA在NAFLD輕度、中度、重度組的濃度比較[M(Q1,Q3),nmol/L]

討 論

研究顯示,非酒精性肝脂肪變大約30%進展為非酒精性脂肪性肝炎,3%進展為肝硬化,因此早期診治NAFLD具有重要意義[8]。膽汁酸由膽固醇代謝產生,是膽汁中的重要組成成分,主要在肝臟合成,在遠端小腸中被強烈吸收并返回肝臟進行再分泌,從而在肝臟和腸道之間持續循環。膽汁酸合成途徑包括經典途徑和替代途徑,經典合成途徑限速酶是膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7-α hydroxylase, CYP7A1),替代途徑由細胞色素P450家族成員27A1(cytochrome P450 27A1,CYP27A1)和氧甾醇12α-羥化酶(cytochrome P450 7B1,CYP7B1)啟動,經典途徑產生大部分膽汁酸[9]。

NAFLD 患者血清膽汁酸譜改變的結果在不同研究中不一致,Zhou等[10]研究發現,NAFLD患者中血清總BA、CDCA、DCA、GCA、TCA、GDCA、TDCA、GCDCA、TCDCA和TLCA隨著NAFLD的嚴重程度增加而增加,Xie等[11]、Nimer等[12]研究發現,NAFLD患者中CA、DCA、TCA、TDCA和TCDCA的水平較健康組顯著增加,朱悅等[13]研究發現,NAFLD組較健康組患者CA、CDCA、GCA含量明顯升高,LCA含量明顯降低,而本研究中早期NAFLD組患者的總BA的水平較高,初級膽汁酸(總初級游離膽汁酸、總初級結合膽汁酸、總初級膽汁酸)、次級膽汁酸(總次級結合膽汁酸、總次級膽汁酸)、總游離膽汁酸、總結合膽汁酸、總初級/次級膽汁酸高于健康組,總游離/結合膽汁酸低于健康組(P<0.05),膽汁酸譜亞組分中血清CA、GCA、TCA、GDCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、GUDCA、TUDCA、TLCA高于健康組(P<0.05),LCA低于健康對照組(P<0.05),與上述研究部分一致。

本研究還發現,GCA、TCA、CDCA、GCDCA、TCDCA、GUDCA、TLCA是NAFLD患者的獨立危險因素,且均可在一定程度上預測NAFLD的發生,其中GCA的敏感度最高(77.2%),TLCA特異性最強(88.6%);血清TCA濃度隨著NAFLD嚴重程度的加重逐漸升高,與易佳音等[14]在肝硬化人群中得出的結果類似。本研究中NAFLD組患者血清GDCA/GCA比值明顯低于健康對照組,提示NAFLD組腸肝循環較健康組減少,可能是NAFLD患者初級膽汁酸的水平增加的原因之一,初級膽汁酸的水平增加還可能與清除初級BA的小腸細菌減少或BA經典合成途徑增加有關[15]。LCA水平在NAFLD組患者中低于健康對照組,可能與BA主要通過激活法尼類X受體(farnesoid X receptor,FXR)和G蛋白偶聯膽汁酸受體1(takeda G protein-coupled receptor 5,TGR5)參與糖脂代謝、能量消耗及炎癥,LCA是FXR、TGR5有效激動劑有關[16]。與既往研究不同的是,本研究中DCA雖在NAFLD組患者中較健康組低,但差異無統計學意義,可能與本研究選取的均為健康體檢的早期NAFLD人群,病情相對較輕有關[17,18]。

綜上所述,早期NAFLD組患者總膽汁酸及BA譜成分發生顯著變化,以初級BA和結合膽汁酸的變化為主,其中TCA水平變化與NAFLD發生、發展密切相關,不僅在一定程度上可以預測NAFLD的發生,其水平還與NAFLD的嚴重程度正相關,對臨床上無創診斷評估早期NAFLD具有一定的意義。本研究尚存在一些不足,如對NAFLD的診斷和嚴重程度分組依據影像學表現,未采用病理學檢查金標準;未評估腸道微生物群對膽汁酸譜的影響;為一個單中心、回顧性的橫斷面研究。此外,本研究選取的對象均為進行健康體檢的人群,可能會造成統計學偏倚。