基于內質網應激應答的膠質瘤風險模型構建

帕拉沙提·斯然 王濤 陳珂 周嘉懿 徐健蓉 李寧寧

1西南科技大學生命科學與工程學院（四川綿陽 621010）；2中山大學附屬第七醫院托馬斯·林達爾諾獎科學家實驗室（廣東深圳 518107）

膠質瘤作為原發性中樞神經系統腫瘤，發病率高［1-3］?，F行診斷標準主要依據IDH分型，治療以手術為主，輔以放化療，但匱乏靶向藥物［4］。在顱外腫瘤中，取得顯著療效的藥物受限于對膠質瘤患者響應亞群難以精準識別的問題［5-6］。因此，亟需新型精準診斷判別體系，以輔助錨定高度響應的患者。

在膠質瘤惡性演進過程中，壓力刺激可能會誘發內質網應激應答（ERS），重塑細胞表型，并促進浸潤性生長［7］。但當ERS超過負荷時，會導致細胞凋亡［8］。這提示，靶向ERS可能成為膠質瘤精準診療的一種新思路。因此，本研究的目標是建立基于ERS分級預后風險模型，以精準判別預后和惡性進展表型，為膠質瘤靶向藥物的研發提供新方向。

1 材料與方法

1.1 數據集和數據收集從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫（xena.ucsc.edu）和中國腦膠質瘤基因組圖譜（CGGA）數據庫（www.cgga.org.cn/index.jsp）中，篩選和選取具有完整臨床信息的測序數據（TCGA，n=683；CGGA，n=517）。將TCGA數據（IDHmt：IDHwt=508：175）和CGGA數據（CGGA325：IDHmt：IDHwt=101：175；CGGA693：IDHmt：IDHwt=176：65）分別作為訓練集和驗證集。通過使用Limma數據包，進行差異基因分析（|logFC|＞1.5，P＜0.005），并在與HALLMARK_UNFOLDED_PROTEIN_RESPONSE基因集交集中篩選顯著差異基因。接下來，運用單基因生存期分析、蛋白互作、Lasso-Cox風險回歸分析和Spearman相關性分析，構建一個包含7個ERS相關基因的膠質瘤風險回歸模型。最后，通過Kaplan-Meier分析和ROC曲線，明確該模型對于高、低風險與患者生存期差異的相關性與預測準確性。

在表達數據進行Log2和Z-score標準化后，明確7個ERS風險因子表達與經典膠質瘤病理分級、分子分型之間的相關性，并使用Pheatmap包和ggplot2包分別創建相關熱圖和箱圖展示這些相關性。

使用診斷性ROC分析，明確CD44（惡性進展）或GPR158（有利預后）與風險評分的相關性。在整合訓練集和驗證集的數據，采用ggplot2繪制點圖和熱圖分別展示CD44/GPR158與ERS風險因子表達的相關性。

1.2 mRNA和蛋白質表達驗證實驗膠質瘤臨床樣本20例（IDHwt：IDHmt=10：10）取自中山大學附屬第七醫院和中山大學腫瘤防治中心，標本通過病理學評估，并附有詳細的臨床病理資料。所有患者均簽署知情同意書，本課題由中山大學附屬第七醫院倫理研究委員會批準（編號：KY-2021-065-01）。

膠質瘤臨床標本（IDHwt：IDHmt=5：5），進行實時熒光定量分析。檢測基因的引物序列見表1。同時，另外10例患者（IDHwt：IDHmt=5：5）標本被制作成石蠟切片，并通過免疫組化方法檢測HSP90B1（Cell Signaling Technology，4874）、HSP5A（Cell Signaling Technology，3177）和CD44（Cell Signaling Technology，37295）的表達情況。實驗采用DAB染色，陽性結果顯色為黃褐色。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統計學方法在本研究中，R語言和Graph Pad Prism 9.4.1作為統計分析工具。按中位風險評分分類后，使用χ2檢驗確定樣本間的臨床特征差異。t檢驗被用于進行組間比較。此外，Pearson相關分析用來評估相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 利用顯著高表達的7個ERS相關基因構建膠質瘤分級預后風險模型首先，根據IDH基因型并利用TCGA轉錄組數據進行差異表達分析（|LogFC|＞1.5，P＜0.05），并與Hallmark_Unfolded_Protein_Response（UPR）基因集進行交集分析，篩選出在IDHmt型膠質瘤中顯著表達的41個UPR/ERS基因以及在IDHwt型膠質瘤樣本中顯著高表達的50個UPR/ERS基因（圖1A）。接著，通過單變量Cox風險回歸分析，發現有33個UPR/ERS基因與膠質瘤不良預后之間存在顯著相關性（圖1B）。最后，通過Lasso + Cox生存分析方法（圖1C和D）篩選出7個關鍵基因，用以構建ERS分級預后風險模型。風險系數計算公式為：風險系數=（0.128 4 *KDELR3）+（0.529 5 * SHC1）+（0.004 3 * DNAJC3）+（0.890 3 * PDIA6）+（-0.119 9 * CALR）+（0.496 4 *HSP90B1）+（-0.752 1 * HSPA5）（圖1C-D）。

圖1 構建基于7個UPR基因的Cox風險模型以預測膠質瘤的預后Fig.1 Characterization of 7 ERS risk signature genes to predict the prognosis of glioma

2.2 ERS模型風險評分與膠質瘤患者預后的關聯分析及預測準確性評估Kaplan-Meier分析顯示，高風險組（高于中位風險分數）的患者預后明顯不如低風險組患者（圖2A-B）。時間依賴性ROC曲線評估顯示，在1年時，預后的預測準確性超過0.7（TCGA：0.74；CGGA：0.82），在3年時超過0.76（TCGA：0.77；CGGA：0.80），在5年時超過0.62（TCGA：0.63；CGGA：0.75）（圖2C-D）。這些結果表明，與ERS相關的風險因子在預測神經膠質瘤患者的預后方面表現出較高的準確性。

圖2 評估ERS相關風險因子預測預后的能力Fig.2 Assessment of the prognostic prediction ability of the ERS-related risk signature

2.3 ERS相關風險因子與膠質瘤經典分子分型和病理級別的關聯性分析ERS相關風險因子是否與神經膠質瘤患者的臨床病理分級存在關聯？針對訓練集（TCGA）和驗證集（CGGA）的數據分析顯示，以IDH基因型分組，這7個ERS風險基因在IDHwt組中呈現顯著高表達（圖3A-B）。進一步，在根據WHO病理分級進行的分組中，與Grade 2相比，這7個ERS相關風險因子在Grade 3膠質瘤中均呈現顯著高表達（圖3C-D）。通過上述分析結果的驗證，ERS相關風險因子能夠有效區分不同膠質瘤患者的經典分子分型和病理分級特征。

圖3 ERS相關風險因子在膠質瘤患者中根據WHO分級劃分的診斷價值Fig.3 Diagnostic values of ERS risk signature genes in glioma patients based on WHO grade classification.

2.4 ERS相關風險因子與膠質瘤惡性進展表型的關聯性分析在膠質瘤惡性進展過程中，CD44在促進細胞間質亞型轉化方面發揮著重要作用，并與膠質瘤的病理分級和預后密切相關［9-12］。Pearson相關性分析顯示，CD44與ERS風險評分顯著正相關（圖4A）。此外，箱圖顯示，在ERS高風險組中CD44表達顯著升高（圖4B）。進一步分析顯示，在將患者根據CD44表達的中位數分為高表達組和低表達組后，ERS相關風險因子在CD44低表達的患者中也呈現低表達（圖4C和D）。

圖4 ERS相關風險因子與膠質瘤惡性進展表型的關系Fig.4 The correlation between ERS-related risk signatures and malignant phenotypes of glioma.

G蛋白偶聯受體GPR158的表達隨膠質瘤級別升高而逐級顯著降低，可作為分級預后標志物；此外，GPR158的高表達能夠有效抑制膠質瘤的惡性進展［13-14］。為進一步驗證ERS風險模型對膠質瘤級別和惡性進展表型評估的獨立性，研究根據GPR158的表達中位數將TCGA和CGGA數據庫數據分為高表達組和低表達組，然后比較這兩組中ERS風險因子的表達趨勢。熱圖分析顯示，在GPR158低表達組中，ERS高風險因子的表達水平顯著增加（圖4E-F）。此外，Pearson相關性分析結果提示GPR158與ERS風險評分之間呈顯著負相關（圖4G）。最后，診斷性ROC曲線顯示，ERS風險評分預測膠質瘤惡性進展表型的準確性超過0.7（圖4H）。綜上所述，這些研究結果強調了ERS風險因子在準確預測膠質瘤惡性進展表型方面的重要能力。

2.5 ERS風險因子在不同IDH基因型臨床膠質瘤樣本中的表達差異分析經臨床樣本的qRT-PCR分析顯示，在IDHwt膠質瘤樣本中，7個ERS相關風險因子的表達顯著高于IDHmt樣本（IDHwt∶IDHmt=10 ∶ 10），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖5A）。鑒于DNAJC3、CALR、PDIA6、SHC1和KDELR3缺乏適用于免疫組化級別的抗體，因此選取ERS風險因子（HSP90B1和HSPA5）與惡性表型標志物（CD44）一同作為免疫組化實驗的指標（圖5B）。免疫組化結果表明，在IDHwt膠質瘤樣本中，風險因子HSP90B1和HSPA5以及CD44的表達明顯高于IDHmt膠質瘤樣本（IDHwt∶IDHmt=5∶5），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖 5C）。

圖5 ERS相關風險因子因子在不同IDH基因型臨床膠質瘤樣本中的表達比較Fig.5 Comparison of the expression of UPR risk signature factors in clinical glioma samples with different IDH genotypes

3 討論

本研究基于美中兩國公共膠質瘤數據庫（TCGA和CGGA）的RNA-seq數據，成功篩選出7個ERS相關風險基因，并建立了一個具備病理分級和預后預測功能的風險回歸模型。該模型在預測膠質瘤患者的短期生存期（1年和3年）方面表現出較高的準確性（AUC＞0.74）。此外，通過生物信息學分析和臨床樣本驗證，發現ERS高風險組與膠質瘤惡性進程標志物CD44呈顯著正相關，而與代表有利預后的前神經元標志物GPR158之間呈顯著負相關。這些發現提示，該模型能夠較為準確地指征膠質瘤的惡性進展表型。

目前，現行的臨床診斷體系分類器在與膠質瘤靶向藥物相匹配方面存在挑戰，例如，盡管IDH突變抑制劑在急性髓細胞性白血病的靶向治療中取得顯著療效［15］，但在膠質瘤治療方面仍處于臨床試驗階段［16-18］。這可能是由于IDHmt以及代謝產物D2HG對膠質瘤細胞的表觀遺傳調控以及代謝重編程產生重要影響，使得精確的靶向治療變得困難［19］。同樣，針對膠質瘤的治療嘗試了多種與現行臨床診斷分類系統相對獨立的靶向策略［20-23］和免疫療法［24-25］。然而，由于缺乏適應于臨床診斷分類的準確分類器，上述努力均難以確定高度響應的患者亞群。這也成為當前膠質瘤靶向治療和未來特異性靶向藥物開發所面臨的重要限制因素。

在新版的《Hallmarks of Cancer：New Dimensions》一文中，表型可塑性被提升為腫瘤標志性事件之一，強調了深入探索和驗證其機制的重要性［26］，也提示未來在研究腫瘤的發生、發展、復發以及耐藥時，需要從基因型和細胞表型的綜合角度進行考慮。當腫瘤細胞受到內部或微環境壓力刺激時，會觸發ERS，從而改變轉錄、翻譯和表觀修飾水平，重新塑造腫瘤細胞表型，以適應潛在的致死性壓力，增強其浸潤性生長能力［7］。因此，推測ERS或是調控腫瘤表型可塑性的重要源頭途徑。有學者［27-28］證實ERS可以驅動結直腸癌細胞表型可塑性；同時，WANG等［29］發現IDH突變介導的ERS調控膠質瘤微環境中腫瘤相關小膠質細胞極性可塑性。這些研究提示，ERS信號通路元件可能是調控膠質瘤實質及其微環境表型可塑性的關鍵組分。因此，在本研究中，構建了一個ERS風險回歸模型，并通過生物信息學分析和臨床樣本驗證，發現該模型高風險組與惡性進展表型標志物如CD44呈顯著正相關，與良好預后標志物GPR158呈顯著負相關。這些結果提示，ERS風險特征能準確預測膠質瘤惡性進展表型，為未來臨床靶向治療提供新的方向。

ERS是腫瘤細胞應對外界和內在壓力的重要調控通路，對腫瘤生長、存活、分化和蛋白質穩態提供關鍵保障［16-18］。然而，它是一個雙刃劍，壓力過度亦會導致腫瘤細胞凋亡。多項研究表明，IDHmt提高膠質瘤細胞對于ERS的敏感性，激活PERK/ATF4信號軸，從而抑制腫瘤的增殖和侵襲能力，促進凋亡［8，30-31］。例如，JOHNSON等［32］發現ERS誘導劑毒胡蘿卜素（Thapsigargin）可以促進膠質瘤細胞凋亡。Hallahan團隊也報道ERS增強GBM對于放療敏感性［33］。近期，WANG等［29］發現激活膠質瘤細胞PERK通路推動腫瘤相關小膠質瘤細胞抗癌極化激活?；谶@種機制，針對ERS進行靶向治療可能成為一種新的方法，通過殺傷膠質瘤細胞來抑制腫瘤的惡性進程，為開發全新的藥物靶向策略提供了潛在的方向。

綜上所述，本研究建立了一套新型的腦膠質瘤（除GBM外）分級預后體系，不僅能夠準確識別膠質瘤惡性進展表型，還能有效地橋接現行腦膠質瘤臨床分子診斷體系與靶向治療所涉及的內在分子機制。前期報道指出IDHwt和IDHmt這兩類膠質瘤本質上屬于內質網應激耐受和敏感型腫瘤，基于這一發現，本研究中合理猜測：未來設計和開發與ERS相關的靶向藥物可能會從這個新型風險模型中受益，從而彌補IDH分子分型無法精準鎖定響應患者亞群的不足。此外，還認為：圍繞分子靶點或信號通路開展的靶向藥物設計或可借鑒本研究的模型方法，即構建臨床診斷體系與待開發靶向機制的融合模型，從而更為有效地提高靶向藥物的適配度。