線粒體相關(guān)基因多態(tài)性與血脂和非酒精性脂肪性肝病的相關(guān)性研究

宋 佳,連麗麗

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科,吉林 長春130021)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是在沒有酒精濫用史或繼發(fā)性肝脂肪變性等其他原因的情況下,肝臟脂肪過度沉積[1]。研究顯示,NAFLD的發(fā)展和向更高級階段的進(jìn)展與遺傳因素有關(guān)[2-3],識(shí)別可能導(dǎo)致嚴(yán)重NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)基因,具有重要意義。NAFLD遺傳決定因素中有一些與線粒體相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP),如維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的超氧化物歧化酶(SOD),包括SOD2和SOD3,它們的功能障礙會(huì)加重與NAFLD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]。另外,有文獻(xiàn)報(bào)道,來自兩個(gè)基因SOD2、SOD3的兩個(gè)多態(tài)性SOD2rs4880、SOD3rs25

36512與NAFLD危險(xiǎn)因素如2型糖尿病有相關(guān)性[5-7]。而高甘油三酯血癥為胰島素抵抗(IR)狀態(tài)下最常見的脂質(zhì)異常,是由于富含TG的脂蛋白(VLDL)的產(chǎn)生增加,并且與小而密低密度脂蛋白顆粒和低HDL-C水平的出現(xiàn)有關(guān),后者在NAFLD進(jìn)展中起作用[8]。說明這兩個(gè)基因多態(tài)性可能與IR狀態(tài)下的血脂異常,尤其是高甘油三酯血癥和低HDL-C水平有關(guān);還提示IR狀態(tài)下的血脂異常可能會(huì)增加NAFLD的嚴(yán)重程度。而與NAFLD發(fā)展相關(guān)的危險(xiǎn)因素胰島素抵抗也可用高TG/HDL-C比率作為其替代指標(biāo)[9]。本研究旨在探討SOD2和SOD3基因多態(tài)性與高TG、低HDL-C、高TG/HDL-C和NAFLD嚴(yán)重程度的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2020年1月至 2022年3月吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科有疑似NAFLD的體征或癥狀和/或有NAFLD危險(xiǎn)因素(吸煙、血脂異常、糖尿病、高血壓和肥胖)的患者396名。除外自身免疫性肝病、藥物、全胃腸外營養(yǎng)等可致脂肪肝的情況,并排除過量酒精攝入,指飲酒折合乙醇量,男性每周小于140 g,女性每周小于70 g。將他們標(biāo)記為NAFLD高危受試者,其中389名受試者經(jīng)CT證實(shí)為NAFLD,并對其嚴(yán)重程度進(jìn)行分級[10-11]。根據(jù)CT 檢測:肝/脾 CT 比值<1.0但>0.7者為輕度,≤0.7但>0.5者為中度,≤0.5者為重度 NAFLD。為評估NAFLD的嚴(yán)重程度,進(jìn)一步將受試者分為兩組,分別為無至輕度和中至重度NAFLD組。其中無至輕度組患者268例,中至重度組患者121例。

體重指數(shù)≥25 kg/m2判定為肥胖。所有異常的脂質(zhì)和脂蛋白譜均遵循國家膽固醇教育計(jì)劃和成人治療小組Ⅲ(NCEP-ATP Ⅲ) 指南。HDL-C值低于第 50 個(gè)百分位數(shù)(HDL-C<1.0 mmol/L)考慮低HDL-C水平,空腹血清TG水平≥1.7 mmol/L考慮高TG水平。受試者的一種或多種血脂水平異常,或目前正在服用降脂藥物,或有血脂異常病史,被定義為血脂異常(DL)。本研究中“高 TG/HDL 比值”的分界點(diǎn)為 3.7,這是通過用于預(yù)測NAFLD嚴(yán)重程度的 ROC 曲線確定的。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢查

禁食12 h后采血,使用貝克曼AU5841全自動(dòng)生化分析儀測定血脂參數(shù)和空腹血糖(FBS),用索靈LIAISON XL2210全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定空腹胰島素水平。胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型評估(HOMA-IR)按[FBS(mmol/L)×空腹胰島素水平(μU/mL)]/22.5計(jì)算。

1.3 DNA提取和基因分型

根據(jù)試劑說明書,使用QIAamp DNA微型試劑盒(Qiagen)從200 μl 全血樣本中提取基因組DNA。將提取的DNA溶解至30 ng/μl,并儲(chǔ)存在-80℃以下。為了對這兩個(gè)SNP進(jìn)行基因分型,使用LightCycler 480系統(tǒng)(Roche Applied Science,German)進(jìn)行了實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和高分辨率熔解(HRM) 分析。擴(kuò)增以10 μl體積進(jìn)行。野生型和突變型純合子通過在PCR前加入具有已知基因型序列的樣本來區(qū)分。未知基因組DNA 30 ng與已知野生型DNA3.0 ng(之前已通過測序確認(rèn))一起用作模板。使用LightCycler 480 基因掃描軟件分析結(jié)果。隨機(jī)選擇的50個(gè)樣本在ABI7000序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems,USA)上通過直接測序進(jìn)行驗(yàn)證。使用HRM或直接測序獲得的基因型結(jié)果彼此一致。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,卡方檢驗(yàn)分析對照組的Hardy-Weinberg平衡(HWE)以及病例組和對照組之間的基因分布差異。非條件Logistic回歸模型計(jì)算優(yōu)勢比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI),評估基因多態(tài)性與NAFLD嚴(yán)重程度的關(guān)系。Kolmogorov-Smirnov 正態(tài)性檢驗(yàn)對連續(xù)變量進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。具有偏態(tài)分布的變量在后續(xù)數(shù)據(jù)分析之前進(jìn)行 log10-轉(zhuǎn)換。t檢驗(yàn)用于比較兩組之間連續(xù)變量的均值。方差分析(ANOVA) 用于比較3個(gè)或更多組之間的變量,之后進(jìn)行事后檢驗(yàn)(Scheffe 程序)。所有連續(xù)變量均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。所有P值均為雙側(cè),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究人群的一般情況

為了進(jìn)一步分析,首先根據(jù)NAFLD程度將研究人群分為兩組,表1顯示了兩組研究對象的一般情況。高TG/HDL-C 比率的受試者頻率在中至重度組(59.5%)中顯著高于無至輕度組(46.3%,P<0.05),表明中至重度組更容易出現(xiàn)高TG/HDL-C 比率。與無至輕度組的患者相比,中至重度組的平均年齡和腰臀比顯著增加,TC、TG、LDL-C和TG/HDL-C水平升高,而HDL-C水平降低(P均<0.05)。

表1 無至輕度NAFLD組和中至重度NAFLD組臨床資料比較

2.2 SOD2和SOD3基因多態(tài)性與TG和HDL-C的關(guān)系

在研究人群中,SOD2 rs4880位點(diǎn)檢測到TT、TC和CC3種基因型;SOD3 rs2536512位點(diǎn)檢測到GG、GA和AA 3種基因型。兩基因多態(tài)性位點(diǎn)的各種基因型分布均遵循HWE(P>0.05)。表2總結(jié)了每個(gè)個(gè)體多態(tài)性中基因型與TG、HDL-C和TG/HDL-C之間的關(guān)系。對于SOD3 rs2536512,與GG型相比,AA型具有更高的 TG水平和TG/HDL-C 比值(P<0.05)。

表2 不同基因型的TG和HDL-C水平

表3為Logistic回歸分析結(jié)果,對于SOD2 rs4880,與TT型相比,CC型出現(xiàn)高TG(≥1.7 mmol/L) [調(diào)整后OR=3.23,95%CI(1.20～8.75),P=0.021)],高 TG/HDL-C 比率(≥3.7) [調(diào)整后OR=2.57,95% CI(1.06-6.24),P0.037]和高TG 合并低 HDL-C(<1 mmol/L) [調(diào)整后OR=3.60,95% CI(1.06-12.19),P=0.040]的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。對于SOD3 rs2536512,與GG型相比,AA型出現(xiàn)高TG [調(diào)整OR=2.09,95%CI(1.08-4.05),P=0.029)]和高TG合并低HDL-C(<1 mmoL/L)的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[調(diào)整后OR=2.87,95%CI(1.27～6.5),P=0.011]。

表3 SOD2和SOD3基因多態(tài)性與TG和HDL-C的關(guān)系

2.3 NAFLD嚴(yán)重程度相關(guān)的危險(xiǎn)因素分析

為了評估血脂水平異常是否可以預(yù)測NAFLD的嚴(yán)重程度,以NAFLD嚴(yán)重程度作為血脂異常的函數(shù)并和其他相關(guān)危險(xiǎn)因素進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果只有高TG/HDL-C比率(≥3.7)與NAFLD的嚴(yán)重程度(中至重度風(fēng)險(xiǎn)組)相關(guān),調(diào)整后的OR=2.26,95%CI(1.17-4.34)(見表4)。

表4 與NAFLD嚴(yán)重程度相關(guān)的危險(xiǎn)因素分析

2.4 SOD2和SOD3基因多態(tài)性與NAFLD嚴(yán)重程度的關(guān)系

進(jìn)一步研究SOD2 rs4880、SOD3 rs2536512位點(diǎn)攜帶的基因型是否與NAFLD的嚴(yán)重程度相關(guān)。所有基因變異均與NAFLD的嚴(yán)重程度沒有關(guān)聯(lián)(見表5)。

表5 SOD2和SOD3基因多態(tài)性與NAFLD嚴(yán)重程度的相關(guān)性

3 討論

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代謝綜合征的一種常見肝臟表現(xiàn),在一般人群中的患病率為20%～30%,其發(fā)病率隨著肥胖發(fā)病率的增加而上升[12-13]。這種疾病包括一系列臨床病癥,從簡單的脂肪堆積到非酒精性脂肪性肝炎(NASH),再到導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)和死亡的晚期纖維化[14]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制是多因素的[15],久坐不動(dòng)、肥胖和相關(guān)合并癥,如糖尿病、血脂異常、胰島素抵抗等都是與NAFLD發(fā)展相關(guān)的重要危險(xiǎn)因素[16-17]。但并非所有具有相似社會(huì)人口學(xué)和身體特征的受試者都會(huì)發(fā)展為 NAFLD,也并非所有患NAFLD的受試者都會(huì)發(fā)展為更晚期的疾病,這表明NAFLD的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展存在明顯的個(gè)體差異[18-19]。

本研究探討了兩種線粒體相關(guān)基因變異與血脂水平、NAFLD嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)。盡管兩種線粒體相關(guān)基因變異的組合與NAFLD的嚴(yán)重程度沒有直接關(guān)系;但它們與高TG、低HDL-C水平顯著相關(guān),本研究首次報(bào)道了這些線粒體相關(guān)基因中的兩種遺傳變異與NAFLD高風(fēng)險(xiǎn)受試者血脂異常之間的聯(lián)系。SOD2c.4C>T(rs4880)的CC型和SOD3c.1G>A(rs2536512)的AA型更容易發(fā)生高甘油三酯血癥和低HDL-C。而本研究發(fā)現(xiàn)中至重度NAFLD組的高TG/HDL-C比值(≥3.7)與NAFLD的嚴(yán)重程度獨(dú)立相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)提示SOD2 c.4C>T(rs4880)CC型和SOD3c.1G>A(rs2536512)AA型的NAFLD高風(fēng)險(xiǎn)人群應(yīng)關(guān)注其TG、HDL-C和兩者比值的變化,防止NAFLD病情進(jìn)一步發(fā)展。總之,本研究中觀察到的SOD2和SOD3多態(tài)性與NAFLD血脂異常的關(guān)聯(lián),可能是由于基因多態(tài)性、其修飾的蛋白質(zhì)功能、其涉及的抗氧化途徑以及研究人群的潛在條件的相互作用。然而,需要進(jìn)一步研究證實(shí)這一假設(shè)。

本研究有一定的局限性,首先,由于新鮮血液的數(shù)量不足,缺乏功能研究來調(diào)查不同基因型對抗氧化基因的表達(dá)以及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。其次,這項(xiàng)研究僅在中國東北地區(qū)漢族人群受試者中進(jìn)行,缺乏其他種族人群的研究,沒有將種族特異性遺傳變異和不同環(huán)境因素帶來的影響考慮在內(nèi)。此外,相對有限的樣本量可能會(huì)影響檢測關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)能力。因此,這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)該被認(rèn)為是探索性的,直到它們可以在更大的樣本量中被復(fù)制。

線粒體相關(guān)基因中的兩種多態(tài)性(SOD2 rs4880和SOD3 rs2536512)與NAFLD的嚴(yán)重程度無直接關(guān)系,但高TG/HDL-C比率與NAFLD的嚴(yán)重程度相關(guān),高TG/HDL-C 比率是NAFLD病情進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。對于NAFLD的高風(fēng)險(xiǎn)人群,SOD2 rs4880位點(diǎn)攜帶CC基因型和SOD3 rs2536512位點(diǎn)攜帶AA基因型的個(gè)體更容易發(fā)生TG水平和HDL-C異常,攜帶危險(xiǎn)基因型的這類人群應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注其TG、HDL-C水平和兩者比值變化情況,防止NAFLD進(jìn)展,病情惡化。